Box—Behnken响应面法优化亚贡多糖的脱蛋白工艺研究

王晓玲+高翔+王秋月+张玲艳

【摘 要】 目的：筛选亚贡多糖的脱蛋白工艺。方法：采用酶法脱蛋白，应用Box-Behnken 响应面法优化最佳工艺，以多糖质量分数和蛋白脱除率为评价指标，考察温度、反应时间及酶浓度对指标的影响。结果：最优工艺条件为：反应温度为56-2℃，反应时间为1-27 h，酶终浓度3-7%；多糖质量分数达67-5%，蛋白脱除率为80-4%。结论：该工艺简单可行，可用于亚贡多糖的纯化。

【关键词】 亚贡；多糖；脱蛋白；Box-Behnken 响应面法

【中图分类号】R914-1 【文献标志码】 A 【文章编号】1007-8517（2015）18-0012-02

Study on Deproteinization from Polysaccharides of Smallanthus sonchilius

WANG Xiaoling GAO Xiang WANG Qiuyue ZHANG Lingyan

The Second Hospital of Tianjin Medicine University， Tianjin 300211， China

Abstract：Objective To optimum conditions for deproteinization form polysaccharides of Smallanthus sonchilius. Methods Box-Behnken Design-Response surface methodology was used to optimize the process of deproteinization and the method was evaluated by the ratio of protein removing and the mass fraction of polysaccharide. Results The better conditions for the deproteinization of crude polysaccharide from Smallanthus sonchilius were that the temperature was 56-2℃， the final concentration of enzyme was 3-7%（m/v） and the reaction time was 1-27 h. Under these conditions， the content of crude polysaccharide was 67-5% and percentages of protein removing of crude polysaccharide was 80-4%. Conclusion The method of enzyme effective method for removal of protein.

Keywords：Smallanthus sonchilius； Polysaccharides； removal of protein； Box-Behnken Design-Response surface methodology

亚贡（yacon）为菊科多年生草本植物亚贡Smallanthus sonchifolius H-Robinson的块根，又称雪莲果、雪莲薯、菊薯、亚龙果等。常用于加工为饮料、茶及蔬菜等各种产品，也可作为水果直接食用。研究表明，亚贡除作为营养保健品外，还具有一定的药用价值，具有降血糖、抗动脉粥样硬化、调节免疫、抗氧化、改善胰岛素抵抗等药理活性[1-5]。目前，亚贡的研究主要集中在根茎中的低聚果糖及叶片中多糖的提取分离及应用，尚未见亚贡根茎中多糖的研究。而植物多糖具有免疫调节、降血糖、降血脂等作用，对亚贡多糖的研究具有一定意义。多糖在提取和纯化的过程中常伴有大量植物蛋白，脱蛋白成为提高多糖纯度的必备工艺。常用的脱蛋白方法包括：Sevage法（正丁醇与氯仿混合）、三氯乙酸法（TCA法）、酶法。Sevage法和TC法是应用化学试剂使蛋白变性，反应较为强烈，对多糖造成一定的损耗[6]，而酶法条件较为温和，简单易行，专属性强。研究选用酶法，以多糖质量分数和蛋白脱除率为考察指标，采用响应面法对酶法提取的反应温度、时间和酶的浓度进行优化，为亚贡多糖的合理开发提供实验依据。

1 仪器与材料

1-1 仪器 TU-1810紫外可见分光光度计（北京普析通用仪器有限责任公司）；旋转蒸发仪（天津科诺仪器设备有限公司）；电子天平（北京赛多利斯仪器系统有限公司）。

1-2 材料 牛血清白蛋白（美国 Amresco 公司）；考马斯亮蓝G-250（北京鼎国昌盛公司）；木瓜蛋白酶（8×105 U/g，上海士锋生物科技有限公司）；所用试剂均为分析纯。

亚贡购于天津市南开区农贸市场，经天津中医药大学张坚老师鉴定为亚贡Smallanthus sonchifolius H-Robinson的块根。

2 方法与结果

2-1 亚贡多糖的提取 将亚贡洗净、切片，于60 ℃烘箱中烘干，粉碎，过60目筛，取亚贡干粉末500 g，加20倍量80%乙醇浸提2 h，温度为90℃，过滤，提取液减压浓缩至一定体积，加入适量95%乙醇，4℃冰箱过夜，8000 r/min 离心10 min，弃上清得沉淀[7]。冷冻干燥后得粗多糖，测定粗多糖的质量分数为45-4%。

2-2 葡萄储备液的配置 称量葡萄糖标准品2-86 mg至10 ml容量瓶中，加蒸馏水稀释至刻度，放置4℃冰箱，为储备液备用。

2-3 线性关系考察 分别吸取葡萄糖储备液0、2、4、6、8、10 ml置于50 ml棕色容量瓶中，加水稀释至刻度。依次吸取不同浓度的葡糖糖稀释液1-0 ml，置干燥试管中，分别加5%苯酚1-0 ml，混匀，在沿试管壁缓缓加入浓硫酸5-0 ml，摇匀，室温放置30 min后，以取蒸馏水1-0 ml作为空白对照，检测波长为490 nm，以葡萄糖质量浓度（C）为横坐标，吸光度（A）为纵坐标，得回归方程为：C=109-1A + 2-997，相关系数r=0-9986。

2-4 蛋白质储备液的配置 称取牛血清白蛋白标准品7-41 mg，移至50 ml棕色容量瓶中，加蒸馏水稀释至刻度，混匀，备用。

2-5 蛋白质线性关系考察 分别吸取不同浓度蛋白质储备液0、0-2、0-4、0-6、0-8、1-0 ml置于10 ml的容量瓶中，依次向各试管中加入1 ml的各组稀释液和3 ml考马斯亮蓝G-250溶液，摇匀，以蒸馏水稀释，定容至刻度；空白组加入1 ml的蒸馏水，室温放置30 min，检测波长为595 nm。以牛血清白蛋白质量浓度（C）为横坐标，蛋白质吸光度（A）为纵坐标，对所得数据进行线性回归，得方程为：C=181-3A+ 2-971，相关系数r=0-9982。

2-6 多糖测定 吸取样品溶液1-0 ml，按“2-3”项测定方法操作，得到吸光度值，根据葡萄糖标准曲线方程，计算样品中多糖含量。

2-7 蛋白质的测定 吸取样品溶液1-0 ml，按“2-5”项定方法操作，得到蛋白质吸光度值，根据蛋白质标准曲线方程，计算样品中蛋白质含量。

2-8 脱蛋白工艺优化 精确配置0-8 g/ml的多糖溶液，选择反应温度、反应时间和木瓜蛋白酶浓度3作为考察因素，根据Box-Behnken试验设计条件，设计3因素3水平分析方法，实验设计和实验结果分别见表1、2。

表1 因素水平表

表2 Box-Behnken试验设计及结果

将结果输入Design-Expert 8-0软件进行分析和二项式拟合，以OD值为Y值，提取温度、反应时间和酶终浓度为自变量，模型方程为：Y=73-89+5-27X1+6-90X2+17-21X3+5-71X1X2+2-73X1X3+1-53X2X3-15-14X12-12-41X22-11-52X32。R2=0-9925，拟合优度较佳，可进行预测分析。

经过二项式方程模拟和工艺预测分析得出，多糖质量分数可达到68-4%，蛋白脱除率最大值为78-3%，最优工艺条件温度56-2℃，反应时间1-27 h，酶终浓度3-7%。3个因变量对多糖质量分数和蛋白脱除率总评归一值的影响效果图见图1。

2-9 验证试验 将“2-8”的最优工艺条件进行3次重复试验，测得实际多糖质量分数为67-5%，偏差为1-3%；蛋白脱除率为80-4%，偏差为-2-7%。

3 讨论

多糖存在于细胞膜结构中，是生命体的基本组成部分，参与多种生命功能活动。多糖具有抗肿瘤、调节免疫、抗氧化、延缓衰老、抗辐射、降血糖、降血脂等广泛药理活性。亚贡除作为营养保健品外，还具有一定的药用价值，有较为广泛的开发利用前景，且不同来源的多糖对机体的免疫功能具有不同程度的调节作用。亚贡多糖具有一定抗氧化活性[7]，而其他药理活性有待发现。TCA法除蛋白的原理是沉淀蛋白质，对蛋白的清除率比较大，但会导致多糖的大量降解[8]。酶法原理是水解蛋白质，反应条件温和，避免了多糖的大量降解，无污染，使蛋白质脱除率达到理想状态，而使多糖的损失率降至最低。实验通过Box-Behnken 响应面法对酶法水解蛋白条件进行优化分析，确定了

最佳水解蛋白的工艺条件，产品也由黑色粉末转变为灰白色粉末，多糖质量分数由42-1%提高到67-5%，提高了亚贡多糖的纯度，为亚贡多糖的综合利用提供新的途径。参考文献

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（收稿日期：2015-06-15）