提取方法对箬叶总黄酮抑菌效果的影响

乐 薇，佘雨珊，吴士筠

（武汉工商学院环境与生物工程学院，湖北 武汉430065）

我国箬叶资源丰富但利用率低，目前主要用作食品包装。黄酮类化合物是植物重要的次级代谢产物，具有抗氧化、清除自由基、抗菌、抗癌等多种生理功能[1－3］。研究表明，总黄酮是箬叶中的重要活性成分，但目前的研究多限于黄酮的提取与测定[4－7］。

作者通过抑菌圈直径及最低抑菌浓度的测定，分别考察乙醇浸渍法、热回流法、微波法、超声波法提取的箬叶总黄酮的抑菌效果，选择提取箬叶总黄酮的最优方法，以期为提高箬叶的附加值和箬叶总黄酮的开发利用提供参考。

1 实验

1.1 材料、试剂与仪器

箬叶，采于湖北恩施武陵山区。

金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、大肠杆菌（Escherichia coli）、青霉菌（Penicillium）、酿酒酵母菌（Saccharomyces cerevisiae）、白色念珠菌（Moniliaalbican），武汉工商学院生物实验室提供。

芦丁标准品、氨苄青霉素，中国药品生物制品检定所。

DHP－9272型恒温培养箱、HZQ－F160型振荡培养箱，哈尔滨东联生化仪器有限公司；YXQ－LS－SⅡ型全自动立式电热压力蒸汽灭菌器，上海博讯实业有限公司医疗设备厂；722E型可见分光光度计，上海光谱仪器有限公司；KQ－100E型超声波清洗器，昆山超声仪器有限公司；M700型美的微波炉，广东美的微波炉制造有限公司。

1.2 方法

1.2.1 箬叶总黄酮的提取及纯化

取适量箬叶清洗干净，50℃烘干后粉碎，过18目筛，密封保存。按前期实验获得的优化条件（表1 ），分别采用乙醇浸渍法、热回流法、超声波法及微波法提取箬叶总黄酮，测定提取液中总黄酮含量并计算提取率。提取液减压浓缩蒸去乙醇，并经AB－8型大孔树脂吸附饱和，用75%乙醇洗脱。收集洗脱液，减压浓缩成浸膏，用适量75%乙醇溶解，使各种提取法所得总黄酮的浓度尽可能一致，即得箬叶总黄酮样品液。

表1 4种提取方法的优化条件Tab.1 Optimum conditions of four kinds of extraction method

1.2.2 箬叶总黄酮提取率的测定

准确称取芦丁标准品15mg溶于30%乙醇，定容至100mL。用移液管分别取一定量的芦丁标准溶液于10mL容量瓶中，加入5%亚硝酸钠溶液0.3mL，混匀，静置6min后加入10%硝酸铝溶液0.3mL，摇匀，静置6min后加入4mL 4%氢氧化钠溶液，以30%乙醇定容，摇匀，静置10min后在510nm波长处测定吸光度，参比为不加芦丁标准品的溶液。以吸光度（A）为纵坐标、芦丁标准溶液浓度（c）为横坐标绘制标准曲线，拟合得到线性回归方程为A＝0.0105c＋0.0017，R2＝0.9998。

以箬叶总黄酮提取液代替芦丁标准溶液同法测定总黄酮浓度，箬叶总黄酮提取率按下式计算：

式中：c为总黄酮浓度，μg·mL－1；m为箬叶粉末质量，g；V为溶液体积，mL；n为稀释倍数。

1.2.3 箬叶总黄酮的抑菌实验

1）抑菌圈的测定

将供试菌种分别接种于相应的培养基斜面上，细菌（金黄色葡萄球菌、大肠杆菌）于37℃培养24h进行活化，真菌（白色念珠菌、酿酒酵母菌、青霉菌）于28℃培养24h进行活化。从活化后的斜面上挑取菌体于相应的液体培养基中，37℃培养至对数生长期。分别吸取各对数生长期菌液500μL至一定量的无菌水中，配制浓度为1×106CFU·mL－1的菌悬液，摇瓶培养48h，备用。

将约15mL的固体培养基倒入平板（直径9cm）中，水平放置，待其凝固后用移液器取0.5mL菌悬液注入平板，并用三角棒涂布均匀，每种菌设置3个重复平板。取灭菌滤纸片（直径6mm）放入上述各总黄酮样品液中浸泡24h，取出贴在含菌平板上，用75%乙醇和氨苄青霉素作对照，每皿贴3片。细菌置（37±1）℃培养18～24h、真菌置28℃培养48h后观察结果。测定滤纸片的抑菌圈直径，比较抑菌效果。

2）最低抑菌浓度的测定

采用连续稀释法测定最低抑菌浓度。在无菌条件下，量取一定量箬叶总黄酮提取液，倒入已灭菌的空试管中，再加入相应的液体培养基，使培养基中箬叶总黄酮提取液的质量浓度（mg·mL－1）分别为2、4、9、20、40，混合均匀，分别接入100μL的菌液后在相应条件下培养一段时间，观察菌体生长情况。

2 结果与讨论

2.1 提取方法对箬叶总黄酮提取率的影响（表2 ）

表2 提取方法对箬叶总黄酮提取率的影响Tab.2 Effect of extraction methods on extraction rate of total flavonoids from indocolamus leaves

由表2 可知，热回流法和超声波法的总黄酮提取率相当，乙醇浸渍法的提取率略低，微波法的提取率最低。

2.2 不同提取方法提取的箬叶总黄酮的抑菌效果（表3 ）

表3 不同提取方法提取的箬叶总黄酮的抑菌效果（n＝3）Tab.3 Antibacterial effect of total flavonoids from indocalamus leaves extracted by different extraction methods（n＝3）

由表3 可知，大肠杆菌和金黄色葡萄球菌对4种箬叶总黄酮均较为敏感，酿酒酵母菌对4种箬叶总黄酮均不敏感，白色念珠菌和青霉菌对4种箬叶总黄酮部分敏感。其中，大肠杆菌对4种箬叶总黄酮的敏感程度为：乙醇浸渍法＞超声波法＞热回流法＞微波法；金黄色葡萄球菌对4种箬叶总黄酮的敏感程度为：超声波法／热回流法＞乙醇浸渍法＞微波法。超声波法提取的箬叶总黄酮对青霉菌有一定的抑制作用，热回流法提取的箬叶总黄酮对白色念珠菌有一定的抑制作用。表明，箬叶总黄酮对细菌的抑制作用大于对真菌的抑制作用，且提取方法对箬叶总黄酮的抑菌能力有影响。这可能是由于不同的提取方法获得的黄酮种类有差异，但具体原因还有待进一步研究。

2.3 不同提取方法提取的箬叶总黄酮的最低抑菌浓度（表4）

表4 最低抑菌浓度的测定结果Tab.4 Determination results of minimal inhibitory concentration

由表4可知，超声波法提取的箬叶总黄酮对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和青霉菌的最低抑菌浓度均为39.9mg·mL－1；热回流法提取的箬叶总黄酮对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和白色念珠菌的最低抑菌浓度均为46.2mg·mL－1；乙醇浸渍法提取的箬叶总黄酮对金黄色葡萄球菌的最低抑菌浓度为22.0mg·mL－1，对大肠杆菌的最低抑菌浓度为44.0mg·mL－1；微波法提取的箬叶总黄酮对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的最低抑菌浓度均为48.0mg·mL－1。

3 结论

通过抑菌圈直径及最低抑菌浓度的测定，分别考察乙醇浸渍法、热回流法、微波法、超声波法提取的箬叶总黄酮对细菌（金黄色葡萄球菌、大肠杆菌）、真菌（白色念珠菌、酿酒酵母菌、青霉菌）的抑菌效果。结果表明，箬叶总黄酮对细菌的抑制作用大于对真菌的抑制作用，且提取方法对箬叶总黄酮的抑菌能力有影响，不同提取方法提取的箬叶总黄酮抑菌效果为：超声波法＞热回流法＞乙醇浸渍法＞微波法。超声波法比较适合于箬叶总黄酮的提取。

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