一种制备结直肠癌原位移植瘤动物模型的方法

杨喜花， 李耀平， 任连生， 赵莉莉， 杨永明， 阎　磊， 白喜花

（山西医科大学附属肿瘤医院 1. 比较医学部， 太原　030013； 2. 肛肠科， 太原　030013）

一种制备结直肠癌原位移植瘤动物模型的方法

杨喜花1， 李耀平2， 任连生1， 赵莉莉1， 杨永明1， 阎磊1， 白喜花1

（山西医科大学附属肿瘤医院 1. 比较医学部， 太原030013； 2. 肛肠科， 太原030013）

目的设计一种制备小鼠肠原位移植瘤模型的新装置，并用其建立结直肠癌原位移植瘤动物模型。方法制备一种建立小鼠结直肠癌原位移植瘤的装置，使用该装置于KM小鼠结直肠原位接种1×106的H22肿瘤细胞，观察其成瘤情况及肿瘤转移情况。结果将H22细胞接种于昆明小鼠结直肠部位， 小鼠平均生存时间为16.5±4.5 d。动物死亡后解剖，观察到6只动物全部形成肿瘤， 成瘤率为100%， 个别动物有骼淋巴结转移， 转移率为33.3%。结论采用自制结直肠癌原位接种器可成功建立结直肠癌原位移植瘤动物模型，该方法具有操作简便，成瘤率高的优点。

结直肠癌； 原位移植瘤； 动物模型

结直肠癌是一种常见的严重威胁人类生命健康的恶性消化道肿瘤，发生率仅次于为胃癌和食道癌［1］。近年来结直肠癌的发病率逐年增加，发病人群趋于年轻化， 但总体治愈率没有得到显著提高［2-4］。本文采用自制的结直肠癌原位接种装置建立结直肠癌原位移植瘤动物模型。

1　材料与方法

1.1实验动物及分组

清洁级雄性KM小鼠6只，5～6周龄，山西省肿瘤研究所生产［SCXK（晋）2012-0001］。

动物饲养于清洁级动物屏障环境设施［SYXK（晋）2012-0001］，24～26 ℃，相对湿度40%～60%，12 h/12 h照明。饮用水经高压115 ℃灭菌，用无菌全价营养饲料（北京科奥协力饲料有限公司生产）喂养。

1.2自制接种器及其使用方法

自制接种器如图1所示，包括一个扩张固定管1和注射器2，扩张固定管1前端面下部沿其长度方向凸出形成管头3，扩张固定管1上部沿其长度方向开设有直线形注射孔4，使用时注射器的针头插入注射孔4，针头长度大于注射孔4长度，注射孔4的内侧端口位于管头上方的扩张固定管1前端面、外侧端口位于扩张固定管1的外端面； 扩张固定管1末端连接一个与扩张固定管具有折弯角的握持部5。注射孔4的直径为0.45～0.5 mm，长度为8～10 mm。扩张固定管直径为3～4 mm， 管头长度为3～4 mm。采用1 mL一次性无菌注射器进行注射。

使用时，先将扩张固定管前端涂润滑剂，插入小鼠肛门内并固定，将注射器经注射针孔插入将细胞悬液注入结肠壁下，退出针头，缓缓拔出扩张固定管即可。扩张固定管起到固定直肠的作用。管头与扩张固定管的结合部位的附近区域形成一个直肠折角，直肠贴紧扩张固定管前端面，使注射器针头能够容易内探到直肠。

图1　自制小鼠结直肠癌原位移植瘤接种器示意图

1.3细胞株

小鼠肝癌细胞株H22由河北医科大学实验动物中心馈赠。复苏冻存的H22细胞， 接种于KM小鼠的腹腔， 无菌抽取接种后7 d的腹水， 用生理盐水洗涤1次， 再用生理盐水调整细胞浓度为1×107/mL。

1.4接种方法

一人固定小鼠使其处于仰卧位，另一人取浸泡于质量分数0.01%新洁尔灭溶液中消毒的自制接种器，头部蘸小许液体石蜡，从肛门处缓缓插入，插入段全部没入肛门，注射器抽取细胞悬液100 μL，将注射器针头全部插入注射孔，缓慢注入细胞悬液，3～5 s后，轻轻旋转注射器90度，缓慢拔出针头即可（图2）。

1.5指标观察

接种后动物常规饲养管理， 每日观察动物的活动及采食情况， 如果发现动物有死亡， 及时解剖， 观察记录直肠处是否有肿瘤生长。观察期为30 d， 观察期结束， 颈椎脱臼处死动物， 解剖观察动物成瘤情况及淋巴结转移情况， 统计小鼠的肿瘤生成率及淋巴结转移率。

2　结果

将1×106的H22细胞接种于KM小鼠结直肠部位，在小鼠肛门处观察到有黑色粪便结痂或出现稀便现象， 下腹部略隆起； 小鼠生存时间为11～22 d，平均生存时间为16.5±4.5 d。动物死亡后解剖，观察到6只动物全部形成肿瘤，所成肿瘤全部位于耻骨所形成的环内， 并且向腹腔内生长； 个别动物有骼淋巴结转移， 转移率为33.3%。由于肿块的压迫，尿液无法排出， 膀胱大多呈充盈状态（表1、图3）。

表1　KM小鼠结直肠原位接种H22细胞后的情况

图2　使用自制接种器进行小鼠的细胞接种

图3　小鼠成瘤及转移情况

3　讨论

目前在建立肿瘤动物模型时，大多采用皮下肿瘤细胞注射法。无论是肝癌、胃癌、宫颈癌、肺癌等，均将肿瘤细胞接种于小鼠的皮下或肌肉，形成体表或皮下肿瘤。这样接种形成的肿瘤与临床常见的自然发生的肿瘤在生长环境和病程进展等方面均有较大的差异。

原位移植能更好地模拟结直肠癌的临床生物行为［5］，比如肿瘤的局部生长，肿瘤的浸润，癌细胞原位脱落穿过血管壁进入门静脉循环血运转移等过程。建立肿瘤原位移植瘤，以往大多采用手术方法，比如要建立直肠癌动物模型，需要将腹腔打开，将肿瘤细胞搁于肠壁下，实验操作比较困难， 造成失误较多，且术后护理工作量大，动物死亡率高， 也难以建立大量的动物模型供实验使用。

为了解决这一问题， 作者制备了一种用于建立小鼠原位结直肠癌模型的装置，可方便地应用于原位结直肠癌小鼠模型的建立。在熟练掌握操作技术的前提下，接种成功率可达100%。使用该装置制备小鼠直肠癌原位移植瘤动物模型具有操作简便对动物损伤小、成瘤率高、方便实用等优点。结直肠癌原位移植瘤动物模型的建立为结直肠为结直肠癌的防治研究工作提供了方便适用的模型动物。

［1］董广才. 奥沙利铂联合5-FU/CF治疗直结肠癌的临床研究［J］. 中国中医药咨询， 2012， 12（2）:54-55.

［2］Sun D， Yu F， Ma YK， et al. MicroRNA-31 activates the RAS pathway and functions as an oncogenic MicroRNA in hu man colorectal cancer by repressing RAS p21GTPase acti vating protein 1（RASA1）［J］. J Biol Chem， 2013， 288（13）9508-9518.

［3］李慧慧， 宋宝， 王哲海. 结直肠癌miRNA相关基因单核苷酸多态性与预后相关性研究现状［J］. 中华肿瘤防治杂志2014， 21（1）:77-80.

［4］林志， 赵晶， 辛彦. Bmi-1蛋白在结直肠癌组织中的表达及其临床意义［J］. 实用肿瘤学杂志， 2010， 24（2）:101-107.

［5］Céspedes MV， Espina C， García-Cabezas MA， et al. Ortho topic microinjection of human colon cancer cells in nud mice induces tumor foci in all clinically relevant metastati sites［J］. Am J Pathol， 2007， 170:1077-1085.

A Method for Establishing Colorectal Orthotopic Transplantable Cancer in Mice

YANG Xi-hua1， LI Yao-ping2， REN Lian-sheng1， ZHAO Li-li1， YANG Yong-ming1， YAN Lei1， BAI Xi-hua1

（1. Department of Comparative Medicine， 2. Department of Colorectal and Anal Surgery，Shanxi Cancer Hospital， Shanxi Medical University， Taiyuan 030013， China）

ObjectiveTo develop a self-made inoculator for establishing orthotopic transplantable colorectal cancer in mice. Methods An inoculator for establishing orthotopic transplantable colorectal cancer in mice was designed and made. The inoculator was used for inoculating 1×106H22 cells into colorectal site of each KM mice， and the tumor formation and metastasis was observed. ResultOrthotopic transplanted H22 cells to colorectal site of Kunming mice， the tumor formation rate was 100%， the tumor metastasis rate was 33.3%， and the average lifetime of the mice was 16.5±4.5 d. ConclusionThe self-made inoculator could be successfully used for establishingorthotopic transplantable colorectal cancer in mice. The operation was convenient， and the tumor formation rate was high.

Colorectal cancer； Orthotopic transplant； Animal model

Q95-33

A

1674-5817（2015）04-0305-03

10.3969/j.issn.1674-5817.2015.04.009

2015-05-31

山西省实验动物专项基金课题［2014（K03）］

杨喜花（1980-）， 女， 博士， 主管技师。E-mail: yangxihua@126.com。

李耀平（1966-）， 男， 主任医师，E-mail: liyaoping1600@sina.com