金黄仓鼠Apoa5基因表达载体的构建及在不同组织器官中的差异表达

董婉维， 张婀娜， 郭晓冲， 魏政立， 杨　葳， 周生来， 赵　文， 郑志红

（中国医科大学实验动物部， 沈阳　110001）

金黄仓鼠Apoa5基因表达载体的构建及在不同组织器官中的差异表达

董婉维， 张婀娜， 郭晓冲， 魏政立， 杨葳， 周生来， 赵文， 郑志红

（中国医科大学实验动物部， 沈阳110001）

目的构建金黄仓鼠载脂蛋白A5（Apoa5）基因表达载体以及在不同组织中的表达差异分析，为深入研究Apoa5基因在金黄仓鼠不同组织中功能奠定基础。方法提取金黄仓鼠肝脏组织总RNA，采用RT-PCR方法对金黄仓鼠Apoa5基因的cDNA进行克隆，构建Apoa5基因表达载体并将其转染293T细胞，分别采用RT-PCR和Western blot方法检测mRNA及蛋白质表达水平。采用荧光定量PCR检测并分析Apoa5 mRNA在8个组织中的表达量。结果经PCR检测鉴定，Apoa5基因表达载体构建成功， 经测序分析金黄仓鼠Apoa5基因cDNA全长1 243 bp， 编码366个氨基酸，与人、大鼠、小鼠等物种比对，核苷酸和氨基酸序列均具有较高的同源性，金黄仓鼠与人、大鼠、小鼠的氨基酸同源性分别为75%、84%、84%。转染293T细胞48 h后，RT-PCR和Western blot结果表明，Apoa5基因在mRNA和蛋白质水平都有表达。荧光定量PCR结果显示，Apoa5 mRNA在肝脏表达量最高，在脑和睾丸中中度表达，在心、脾脏、肺、肾、卵巢组织中低度表达。结论 成功构建Apoa5基因表达载体并分析其在不同组织中的表达差异，为制备Apoa5转基因金黄仓鼠动物模型以及研究Apoa5基因在金黄仓鼠脂类代谢中的功能奠定基础。

金黄仓鼠； 载脂蛋白A5（Apoa5）； 基因表达

载脂蛋白A5（Apolipoprotein A5，APOA5）基因最初是2001年由Pennacchio等［1］和Vilet等［2］两个独立研究小组通过比较人与小鼠基因组DNA时发现的一种新载脂蛋白基因。最近研究表明Apoa5基因被科学家们视为影响血脂水平的关键物质［3］。研究人员应用转基因和基因敲除技术分别制备了人APOA5过度表达和基因缺失的小鼠模型，结果显示两种模型对血浆甘油三酯（triglyceride，TG）水平的影响作用相反，Apoa5转基因小鼠的TG水平仅为同窝对照鼠的1/3，而Apoa5基因敲除小鼠血浆TG水平升高4倍［4］。它是第一个明确能够降低血浆TG的载脂蛋白［5］。因此，对Apoa5基因进行深入研究探索Apoa5基因与血脂代谢的关系有着深远的意义。目前，对血脂异常等心脑血管疾病的研究主要集中在人和大、小鼠动物模型，而在金黄仓鼠（Golden hamster， Mesocricetus auratus）上的研究很少。金黄仓鼠在脂类代谢及脂蛋白代谢受体基因序列上更接近人类，是研究血脂代谢的理想的动物模型［6］。本研究对金黄仓鼠Apoa5基因进行克隆，并构建Apoa5基因表达载体，同时分析其在不同组织中的表达差异，为制备Apoa5转基因金黄仓鼠动物模型以及研究Apoa5基因在金黄仓鼠脂类代谢中的功能奠定基础。

1　材料与方法

1.1材料

1.1.1实验动物本试验所用10周龄SPF级金黄仓鼠由北京维通利华实验动物技术有限公司提供［SCXK（京）2012-0001］。

1.1.2主要试剂293T细胞株（中科院上海细胞所）、大肠杆菌菌株DH5α、DMEM， 胎牛血清、胰蛋白酶、脂质体3000（pEF6/V5-His TOPO载体购自Invitrigen公司）， 限制性内切酶、Q5®High-Fidelity DNA Polymerase（购自NEB）、RT-PCR Kit购自Promega。V5 tag 抗体购自Abcam公司。

1.2方法

1.2.1Apoa5表达载体构建提取10周龄金黄仓鼠肝脏组织总RNA，经逆转录酶反转为cDNA。根据NCBI检索到预测的金黄仓鼠Apoa5基因全长cDNA序列，设计针对Apoa5开放阅读框（ORF） 的特异引物，上游引物内含ATG起始密码； 在下游5'-端不加入终止密码， 利用载体上的终止密码。P1: 5'-GTACATCATGGTAAGCATGGC-3'； P2: 5'-GAGTTGAGGAGGCTGGCTAGG-3'。经PCR扩增后，将纯化后的PCR 产物与载体pEF6/V5-His TOPO连接， 连接产物转化感受态细菌Top10， 挑取白色单菌落扩增， 酶切鉴定连接方向并测序鉴定。将测序准确的重组表达载体pEF6/V5-His-Apoa5，经扩增后用Qiagen miniprep 试剂盒大量提取质粒，-20℃冻存备用。

1.2.2细胞转染将5×106的293T细胞接种于6孔板， 待细胞长至90%汇合时， 经脂质体IpofectamineTM3000 Reagent 介导， 分别将pEF6/V5-His-Apoa 5（1 μg）和空载体（1 μg）转染293T细胞。转染48 h后收集细胞。

1.2.3RT-PCR检测Apoa5基因在293T细胞中的表达转染后48 h分别提取每组转染293T细胞的总RNA。总RNA的提取采用Gibco 公司的Trizol试剂，按说明书操作方法进行， 经琼脂糖凝胶电泳鉴定RNA 无降解， 紫外分光光度计测定浓度后，以每管2 μg RNA用于反转录。利用Promega公司逆转录试剂盒将总RNA 反转录成cDNA 第一链。然后以Actin 作为内参照进行PCR 扩增。Apoa5基因RT-PCR引物P1: 5'- GGAAGGGCTTCTGGGACTAC-3'； P2: 5'-TGGTGCTTCACTCGTCTTTG-3'， 扩增片段471 bp。Actin片段大小为248 bp 。PCR 扩增条件为: 94 ℃预变性5 min，94 ℃变性30 s， 58 ℃退火30 s， 72 ℃延伸30 s， 共28个循环， 最后72℃10 min， 然后用1 %琼脂糖凝胶电泳分析结果。

1.2.4Western blot 检测Apoa5基因在293T细胞中的表达共转染48 h 后， 提取重组质粒pSuper-shFank1 631#与pdsRED-Fank1共转染组， pSuper-shFank1 247# 与pdsRED-Fank1共转染组、阴性对照组和空白对照组细胞的总蛋白。培养细胞用冰预冷的PBS 洗2 次后加入裂解液， 冰浴15 min ， 将裂解物10 625×g 离心10 min 后收集上清。在10%SDS-PAGE上分离总蛋白， 然后将蛋白质电转移至PVDF膜上。经5%脱脂奶粉封闭后， 与羊抗鼠V5tag 抗体室温孵育2 h，再经洗膜， 并与辣根过氧化物酶标记的二抗孵育， 最后经ECL发光反应， 并曝光于X光片上。

1.2.5荧光定量PCR测定Apoa5基因mRNA的相对表达量分别提取10周龄金黄仓鼠心、肝脏、脾、肺、肾、脑、卵巢、睾丸共8个组织的总RNA，经逆转录酶反转为cDNA。将cDNA稀释10倍作为PCR扩增模板， 使用TaKaRa SYBR Premix EX Taq TM试剂盒进行定量PCR检测， 25 mL PCR反应体系中含: 上下游引物各1 mL，稀释后cDNA 5 mL，SYBR Premix EX TaqTM 12.5 mL，加水补充至25 mL。PCR反应条件: 95 ℃ 1 min； 95 ℃ 5 s，60℃ 20 s，45个循环，在ABI 7500荧光定量PCR仪上同时检测Apoa5及Actin表达水平，每个样品做3个平行管， 每次实验重复3次， 取平均值。Apoa5正向引物: 5'-GAAGTCCAGCAGCAGT-TAGC-3'； 反向引物: 5'- AGTGAACCTGAGTGAGTA-GACC 3'， 扩增产物为200 bp； Actin正向引物: 5'-GGCACCACACCTTCTACAAC-3'， 反向引物: 5'-TACGACCAGAGGCATACAGG-3'， 扩增产物为186 bp。

2　结果

2.1Apoa5表达载体的鉴定

提取金黄仓鼠肝脏组织总RNA，经甲醛变性凝胶电泳检测可以观察到可见28S、18S和5S三条条带，28S约为18S的二倍，有较好的完整性，经逆转录酶反转为cDNA，利用Apoa5引物扩增获得了1 243 bp的目的片段（图1）。将此目的片段与载体pEF6/V5-His连接，转化，扩增并提取重组质粒DNA，BamH I和Xba I双酶切产生2 条带，大小分别约为5 840 bp 和1 243 bp （图2） 。对重组质粒中Apoa5 ORF目的基因片段进行DNA序列测定，DNA序列与GeneBank上预测的Apoa5序列一致。

图1　金黄仓鼠Apoa5 cDNA扩增结果

图2　质粒经BamH I和Xba I双酶切后电泳结果

2.2金黄仓鼠基因氨基酸序列的同源性比对

通过Blast软件将已扩增出的金黄仓鼠Apoa5基因序列分别与人、大鼠、小鼠的Apoa5基因序列进行比较，分析结果显示金黄仓鼠的Apoa5基因序列与人、大鼠及小鼠都具有较高的同源性，分别为78%，86%、85%。这4个物种的蛋白质长度也非常相似，金黄仓鼠与人的蛋白长度均为366个氨基酸，大鼠、小鼠分别为391和368个氨基酸应用Mega v4.1软件中Clustal X程序进行比对，金黄仓鼠与人、大鼠、小鼠的氨基酸同源性分别为75%、84%、84%。

图3　Apoa5基因的氨基酸序列比对分析结果

2.3pEF6/V5-His-Apoa5表达载体体外表达检测结果pEF6/V5-His-Apoa5质粒转染293T细胞后，抽提细胞总RNA进行逆转录反应，采用特异性引物扩增Apoa5片段， 得到Apoa5基因的目的条带471 bp（图4），转染空载体组无目的条带。同时利用抗V5单克隆抗体检测Apoa5重组融合蛋白的表达。结果显示，在293T细胞中表达的Apoa5重组融合蛋白能特异性结合V5单克隆抗体，融合蛋白在分子量120 000 处显带（图5）。结果证明pEF6/V5-His-Apoa5融合表达载体能够在293T细胞中进行mRNA和蛋白水平的表达。

图4　Apoa5基因的氨基酸序列的系统进化树

图5　RT-PCR鉴定 pEF6/V5-His-Apoa5表达载体在293T细胞中表达

图6　Western blot鉴定pEF6/V5-His-Apoa5表达载体在293T细胞中表达

2.4Apoa5基因在不同组织的mRNA表达差异分析

通过荧光定量PCR分析了Apoa5基因在金黄仓鼠心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、脑、卵巢、睾丸中的表达情况，Apoa5 mRNA在肝脏表达量最高，在脑和睾丸中均有中度表达，在心脏、脾脏、肺、肾、卵巢组织中低度表达。

图7　Apoa5基因在不同组织的mRNA表达差异分析

3　讨论

金黄仓鼠是一种小型啮齿类动物。现已广泛应用于生理学、肿瘤学、遗传学、药理学、毒理学等诸多生物医学领域的科研实验中［7］。金黄仓鼠脂蛋白结构与人相似，有研究认为［8］金黄仓鼠动脉硬化的病理过程与人类十分相似， 是研究糖尿病、高脂血症、动脉硬化发生发展的良好动物模型。目前国内外关于血脂异常相关疾病的研究多取材于大鼠和小鼠。大鼠在血脂代谢与人类存在很大差异， 并且大、小鼠均有抗动脉硬化发生的能力。大鼠血脂水平个体差异较大， 经肝外合成内源性胆固醇比例仅占35%， 人类为90%。而金黄仓鼠的肝脏内源性胆固醇合成比例约为 85%， 与人类更为接近［6］，因此是目前较为公认的研究血脂代谢的动物模型。

Apoa5是近年来发现的载脂蛋白家族新成员，Apoa5经肝脏合成后分泌入血， 存在于高密度脂蛋白（HDL）、极低密度脂蛋白（VLDL）和乳糜微粒中， 主要通过加速血浆总胆固醇（TG）清除及影响VLDL的合成分泌等途径发挥调节血浆甘油三酯代谢的作用。Apoa5不仅在结合、转运脂质及稳定脂蛋白的结构上发挥重要作用， 而且还调节脂蛋白代谢关键酶活性。参与脂蛋白受体的识别， 在脂类代谢中发挥极为重要的作用［9，10］。

本研究运用RT-PCR的方法获得了金黄仓鼠Apoa5基因的cDNA全序列1 243 bp， 编码366 个氨基酸，预测其蛋白分子量为40 140。通过基因序列分析表明，金黄仓鼠的cDNA片段与人、大鼠及小鼠都具有较高的同源性， 分别为78%、86%、85%， 且四者蛋白质的氨基酸长度也相似，金黄仓鼠与人的蛋白均为366个氨基酸，大鼠、小鼠分别为391和368个氨基酸，同源性分别为75%、84%、84%。这说明了Apoa5基因的保守性与其功能的重要性。通过荧光定量PCR分析了Apoa5基因在金黄仓鼠心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、脑、卵巢、睾丸中的表达情况， Apoa5 mRNA在肝脏表达量最高，在脑和睾丸中均有中度表达， 在心脏、脾脏、肺、肾组织中低度表达。人Apoa5基因同样在肝组织表达， 定位在胞浆内，而在脾、血管、小肠、心脏、肺的表达呈阴性［11］， 与本实验结果基本一致。本试验结果表明金黄仓鼠Apoa5主要在肝脏中发挥作用，提示其具有组织特异性。肝脏是TG代谢的主要场所， 动物实验和临床研究证明， Apoa5在体内TG代谢过程中发挥重要作用［12］，但是Apoa5调节TG水平的确切机制目前尚未阐明。为了更进一步研究Apoa5在肝脏中的作用，作者将应用Apoa5基因表达载体， 建立金黄仓鼠Apoa5基因转基因动物模型，Apoa5基因也许能作为预测心血管疾病的新指标和降低血脂浓度的治疗靶点。

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Construction of Golden Hamster Apoa5 Gene Expression Vector and Its Expression in Different Organs

DONG Wan-wei， ZHANG A-nuo， GUO Xiao-chong， WEI Zheng-li，YANG Wei， ZHAO Wen， SHEN Wei，ZHENG Zhi-hong （China Medical University， Shenyang 110003， China）

ObjectiveTo construct apolipoprotein a5 （Apoa5） expressing plamid and describe the gene expression profile of Apoa5 in golden hamster. MethodsTotal RNA was extracted from liver tissue of golden hamster， cDNA of Apoa5 was cloned by RT-PCR， and then subcloned into plasmid. The plasmid of pEF6/V5-His-Apoa5 was transfected into 293T cells， the expression was examined by RT-PCR and Western blot. The expression of Apoa5 in 8 organs， including brain， heart， lung， liver，spleen， kidney， testis， and ovary of golden hamster were also detected by real time PCR. Results Apoa5 expression vector was constructed. Apoa5 mRNA and APOA5 protein was successfully detected in 293T cells 48 h after transfection. Sequencing results showed that the cDNA of Apoa5 contained 1 243 bp，it encodes 366 aa. The Apoa5 gene in golden hamster has high homology with human， mouse and rat. The Apoa5 gene in golden hamster shares 75%， 84%， 84% amino acids with human， rat， and mouse. Real time PCR results showed that gene expression of Apoa5 was high in liver， brain， testis， but low in heart， lung， and kidney. ConclusionThe Apoa5 expression vector was constructed successfully， and Apoa5 expression profile in golden hamster had been described. It may be as the foundation for establishing Apoa5 transgenic golden hamster and researching the function of Apoa5.

Golden hamster； Apolipoprotein A5（Apoa5）； Gene expression

Q95-33

A

1674-5817（2015）04-0283-05

10.3969/j.issn.1674-5817.2015.04.004

2015-05-31

辽宁省科技计划项目（2012408002）

董婉维（1979-）， 女， 动物学硕士研究生。E-mail: magicdww@163.com

郑志红（1969-）， 女， 博士，教授， 从事实验动物转基因与基因敲除研究。E-mail: zhihongzheng@163.com