5-脂氧化酶转基因小鼠表型初步研究

张梅英， 杨　葳， 吴红联， 2， 董婉维， 周生来， 于　洋， 王　惟， 郭晓冲， 郑志红

（1. 中国医科大学实验动物学部， 沈阳　110001； 2. 北京大学实验动物中心， 北京　100871）

·论著·

5-脂氧化酶转基因小鼠表型初步研究

张梅英1， 杨葳1， 吴红联1， 2， 董婉维1， 周生来1， 于洋1， 王惟1， 郭晓冲1， 郑志红1

（1. 中国医科大学实验动物学部， 沈阳110001； 2. 北京大学实验动物中心， 北京100871）

目的建立5-脂氧化酶（5-LO）高表达转基因小鼠模型，为动脉粥样硬化（AS）发病分子机制的研究提供有应用价值的动物模型。方法对5-LO转基因及正常对照小鼠分别选用RT-PCR、免疫组织化学、血脂、血压监测等方法进行分析实验。结果5-LO及大鼠5-脂氧合酶激活蛋白（FLAP）免疫组织化学实验结果显示，在肾和肺中5-LO及FLAP的表达，转基因小鼠高于正常对照组小鼠； RT-PCR实验结果显示， 转基因小鼠与正常对照小鼠比较在骨髓细胞、腹腔细胞、脾脏、肾脏中白三烯介质及其受体均有不同程度的高表达。其中， 两种小鼠的腹腔细胞和骨髓细胞中白三烯A4（LTA4）、白三烯B4（LTB4）和半胱酰胺-白三烯受体2（Cys-LTR2）的表达存在差异（P＜0.05），脾和肾脏中LTB4、白三烯C4（LTC4）及Cys-LTR2的表达存在差异（P＜0.05）， 肾脏中半胱酰胺-白三烯受体1（Cys-LTR1）的表达存在差异（P＜0.05）。C反应蛋白（CRP）、白介素-1β（IL-1β）、血小板衍生因子（PDGF）、坏死因子-κB（NF-κB）等细胞因子检测结果显示， 在肾组织中转基因小鼠的各项指标显著高于正常对照小鼠（P＜0.05）； 血压测定结果显示， 转基因小鼠高于正常对照小鼠（P＜0.05）； 血脂检测结果显示， 两种小鼠未见明显差异（P＞0.05）。结论成功建立5-LO高表达转基因小鼠模型。

5-脂氧化酶（5-LO）； 动脉粥样硬化（AS）； 转基因小鼠

动脉粥样硬化症（atherosclerosis，AS）是冠心病、脑梗死等心血管疾病发生的基础，其发病与高血脂、高血压、内皮损伤、血栓沉积等因素均有一定关系。近年来，AS已被认为是一种慢性炎症反应性疾病［1-4］， 并与5-脂氧化酶（5-lipoxygenase，5-LO）及其衍生物密切相关。5-LO在体内催化花生四烯酸衍生白三烯族（leukotrienes， LTs）炎性介质，5-LO作为代谢反应中的关键限速酶参与AS发生的炎症反应形成过程［5］，但是高表达5-LO导致AS发生的炎症反应机制目前并不完全清楚，为此，作者建立了高表达5-LO的转基因小鼠模型［6］，本文拟对该模型进行相关表型分析，为5-LO过表达与AS发生发展的研究奠定基础。

1　材料与方法

1.1实验动物

选择SPF级5-LO传代阳性转基因小鼠及其同窝成年阴性小鼠（正常对照）进行实验，雌雄不限［SCXK（辽）2013-0001］。饲料购自北京科澳协力饲料有限公司［SCXK（京）2013-0007］。饮用水为高压灭菌酸化水（pH2.5～3）， 动物饲养于12 h明暗循环的屏障系统内［SYXK（辽）2013-0007］。实验过程中对实验用鼠均按照实验动物的3R原则给予人道关怀。

1.2主要试剂

PCR引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成， PCR试剂为大连宝生物工程公司产品， 组织RNA提取试剂盒为Axygen公司产品， 反转录试剂盒为Promega公司产品， 5-LO和5-脂氧化酶激活蛋白（FLAP）抗体为Chemicon公司产品。血脂检测试剂盒为北京中生北控生物科技股份有限公司产品。

1.3免疫组织化学检测

选取8周龄5-LO阳性小鼠及同窝阴性小鼠，脱颈椎快速处死动物，无菌解剖，切取肺和肾固定于质量分数4%多聚甲醛液中，组织经常规乙醇脱水、二甲苯透明后石蜡包埋，石蜡包埋组织切片厚度为5 μm，切片再经二甲苯、梯度乙醇处理，柠檬酸缓冲液中100℃10 min进行抗原修复， 3%H2O2处理10 min去除内源性过氧化物酶， 5-LO（1∶500稀释）和FLAP（1∶100稀释）抗体湿盒中4℃下孵育过夜， DAB显色， 苏木素复染， 光学显微镜下观察。

1.4RT-PCR检测

选取8周龄5-LO阳性小鼠，提取骨髓细胞、腹腔细胞、脾脏、肾脏等组织总RNA并反转录为cDNA， 以cDNA为模板PCR扩增白三烯A4（LTA4）、白三烯B4（LTB4）、白三烯C4（LTC4）、半胱酰胺-白三烯受体1（Cys-LTR1）、半胱酰胺-白三烯受体2（Cys-LTR2）等白三烯类介质； 并以肾脏cDNA为模板， PCR扩增C反应蛋白（C-reactionprotein， CRP）、白介素-1β（IL-1β）、血小板衍生因子（PDGF）、坏死因子-κB（NF-κB）等相关细胞因子（引物序列详见表1）。PCR反应条件均为: 95 ℃预变性5 min， 95℃变性50 s，60 ℃退火30 s， 72 ℃延伸50 s， 扩增30个循环， 72 ℃延伸10 min， PCR扩增产物经1%或2%琼脂糖凝胶电泳后， 采用凝胶成像分析系统进行观察。实验均重复3次， 同时以同窝阴性小鼠为对照， 以β-actin为内参， 上述PCR反应条件扩增25个循环， 电泳结果应用ImageJ软件进行灰度扫描并进行统计学半定量分析。

1.5血压测定

选取8周龄 5-LO阳性小鼠及同窝阴性小鼠各10只采用美国IITC Model 229型无创血压仪进行血压测定， 每只动物测定均重复3次， 选取平均值。

1.6血脂检测

选取8周龄5-LO阳性小鼠及同窝阴性小鼠各10只采用血脂检测试剂盒进行总胆固醇、甘油三酯、高密度脂蛋白、低密度脂蛋白进行测定，按照试剂盒说明书进行操作。

1.7统计学分析

采用SPSS 12 统计软件包进行统计分析，所有实验结果以± s表示，均数比较采用t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1免疫组织化学检测结果

5-LO阳性小鼠及正常对照小鼠的肺、肾脏中5-LO和FLAP蛋白免疫组织化学检测结果见图1和2。免疫组织化学结果显示转基因小鼠5-LO和FLAP表达高于正常小鼠。

表1　白三烯类介质mRNA表达检测引物

图1　5-LO蛋白免疫组织化学检测（×400）

图2　FLAP蛋白免疫组织化学检测（×400）

2.2RT-PCR半定量分析白三烯介质（LTs）及相关细胞因子的mRNA表达结果

5-LO小鼠和正常对照小鼠的骨髓细胞、腹腔细胞、脾脏、肾脏中LTs（LTA4、LTB4、LTC4）及其受体（Cys-LTR1、Cys-LTR2）RT-PCR实验检测结果见图3和图4，实验结果均以β-actin为内参进行比对，统计学分析显示，5-LO小鼠的腹腔细胞和骨髓细胞中LTA4、LTB4 、Cys-LTR2 表达量显著高于正常对照小鼠（P＜0.05）； 5-LO小鼠的脾、肾脏中LTB4、LTC4、Cys-LTR2表达量显著高于正常对照小鼠（P＜0.05）； 5-LO 小鼠的Cys-LTR1只在肾脏中表达高于与正常对照小鼠（P＜0.05）。另外， 5-LO小鼠肾脏中CRP、IL-1β、PDGF、NF-κB等细胞因子RT-PCR检测结果见图5，实验结果以β-actin为内参进行比对，统计学分析显示，5-LO小鼠肾中的CRP、IL-1β、PDGF、NF-κB表达量均高于与正常对照小鼠（P＜0.05）。

2.3血压检测

5-LO小鼠及正常对照小鼠血压分别为91.75± 1.25 mmHg和102.5±1.0 mmHg（P＜0.05）。

2.4血脂检测

图3　白三烯介质RT-PCR检测

图4　白三烯受体RT-PCR检测

图5　细胞相关因子检测

5-LO小鼠及正常对照小鼠总胆固醇、甘油三酯、高密度脂蛋白、低密度脂蛋白各项指标检测结果详见表2，两组动物各项血脂指标比较无统计学差异（P＞0.05）。

表2　小鼠血脂检测　　　　 mmol/L

3　讨论

AS发生是一个慢性反应性疾病过程，属于复杂疾病范畴，其发病由多因素导致，其中炎症反应对AS的发生起到关键作用。5-LO作为生物机体炎症反应过程的中枢酶，特定引导白三烯家族炎性因子的生物合成通路［5］， 其下游产物LTB4、LTC4、LTD4及白三烯E4（LTE4）等一系列炎性因子作为炎症反应的重要介质，影响动脉粥样硬化发生、发展及斑块的稳定性［7］。为此，作者建立了5-LO过表达的转基因小鼠［6］，以期在动物整体水平上观察研究5-LO蛋白过表达与AS发生发展的相互关系。

5-LO主要在巨噬细胞、单核细胞、肥大细胞、树突状细胞中表达，同时巨噬细胞、T细胞、肥大细胞、平滑肌细胞及血管内皮细胞表达白三烯细胞膜受体，白三烯分子与其受体在这些细胞表面以自分泌和旁分泌的形式相互作用，导致AS炎症在血管内壁上的发生和发展［5］。5-LO转基因小鼠在前期RNA和蛋白水平实验中均检测到5-LO及其激活蛋白FLAP的高表达［6］， 本实验中肺和肾脏组织的5-LO及其激活蛋白FLAP免疫组织化学检测结果显示， 5-LO在转基因小鼠表达明显高于正常小鼠，组织学水平实验进一步证实外源目的蛋白在体内稳定表达。5-LO下游产物LTA4、LTB4、LTC4等白三烯介质检测显示其在腹腔细胞、骨髓、脾和肾脏中均有不同程度的表达， 其中LTA4属于5-LO信号途径早期的中间代谢产物， RT-PCR实验中也显示5-LO转基因小鼠骨髓细胞中LTA4高表达（P＜0.05）；LTB4为LTA4其中一条代谢途径的产物，是一种有效的中性粒细胞化学诱导物，它能改变血管通透性，可使白细胞黏附于内皮细胞，在腹腔细胞和血管丛密集的脏器中高表达，对于血管内斑块形成发展发挥重要的作用， 本实验5-LO小鼠腹腔细胞和肾脏中LTB4表达显著高于正常对照小鼠（P＜0.05）LTA4的另一条代谢途径是受特异的谷胱甘肽硫转移酶催化生成LTC4，再经谷氨酰转肽酶和二肽酶催化生成LTD4和LTE4，他们能刺激平滑肌收缩并能改变血管通透性，本实验脾和肾组织中LTC4表达检测结果均与之相符（P＜0.05）。Cys-LTR1 Cys-LTR2等CysLTs的受体在肾组织中表达均明显高于正常小鼠。以上结果均提示5-LO转基因小鼠体内外源目的蛋白的高表达已经启动5-LO通路下游产物的生物合成。

CRP、IL-1β、PDGF、NF-κB等是体内参与免疫应答、炎症反应的细胞因子， 其中CRP、IL-1β均与NF-κB调控相关，CRP水平与炎症的出现及其严重程度密切相关［8］， NF-κB 、PDGF、 IL-1β均不同程度参与动脉粥样硬化进程［9，10］。本实验中，在5-LO小鼠肾组织中RT-PCR检测到CRP PDGF和NF-κB等细胞因子的表达高于正常小鼠（P＜0.05），提示5-LO小鼠体内已经存在炎症反应高发风险。在血脂和血压检测中，血脂未见明显的差异（P＞0.05），但是5-LO小鼠LDL-C检测值低于正常小鼠，总胆固醇检测值二者相似，与理论预期不符，分析原因可能与动物个体差异和实验操作有一定关系，有待于今后进一步的实验验证； 血压检测结果显示5-LO小鼠高于正常小鼠（P＜0.05）但均在小鼠正常血压范围。

综上所述， 5-LO转基因小鼠已经具有高发炎症反应风险，本研究将为探索动脉粥样硬化炎症反应机制实验研究打下基础。

［1］Merched AJ， Ko K， Gotlinger KH， et al. Atherosclerosis evidence for impairment of resolution of vascular inflamma tion governed by specific lipid mediators［J］. FASEB J， 2008 22（10）:3595-3606.

［2］Cipollone F， Mezzetti A， Fazia ML， et al. Association between 5- lipoxygenase expression and plaque instability in human ［J］. Arterioscler Thromb Vasc Biol， 2005， 25:1665-1670.

［3］ Kriszbacher I， Koppán M， Bódis J. Inflammation atherosclerosis， and coronary artery disease ［J］. N Engl Med， 2005， 353（4）:429-430.

［4］李玉洁， 杨庆， 翁小刚， 等. 动脉粥样硬化炎症信号通路研究进展［J］. 中国药理学通报， 2009， 25（7）:857-860.

［5］Lotzer K， Funk CD，Habenicht AJ. The 5-lipoxygenase pathway in arterial wall biology and atherosclerosis［J］. Biochem Biophys Acta， 2005， 1736（1）:30-37.

［6］张梅英， 吴红联， 杨葳， 等. 5-脂氧化酶转基因小鼠模型的制备［J］. 中国实验动物学报， 2010， 18（1）:60-64.

［7］Jawien J，Korbut R. The current view on the role of leukotrienes in atherogenesis［J］. J Physiol Pharmacol， 2010， 61（6）:647-650.

［8］梅卫义， 杜志民， 胡承恒， 等. 妊娠相关血浆蛋白A水平与不稳定心绞痛患者冠状动脉狭窄病变形态的关系［J］. 中山大学学报: 医学科学版， 2005， 24（4）:456-458.

［9］Andrae J， Dallini R， Betsholtz C. Role of platelet derived growth factors in physiology and medicine［J］. Gene Dev，2008， 22（10）:1276-1312.

［10］ Brand K， Page S， Rogler G， et al. Activated transcription factor nuclear factor-kappa B is present in the atherosclerotic lesion ［J］. J Clin Invest， 1996， 97（7）:1715-1722.

A Preliminary Study on Phenotype of 5-Lipoxygenase Transgenic Mice

ZHANG Mei-ying1， YANG Wei1， WU Hong-lian1，2， DONG Wan-wei1， ZHOU Sheng-lai1，YU Yang1， WANG Wei1， GUO Xiao-chong1， ZHENG Zhi-hong1
（1. Laboratory Animal Center， China Medical University， Shenyang 110001， China；2. Laboratory Animal Center， Peking University， Beijing 100871， China）

ObjectiveTo establishment a 5-lipoxygenase （5-LO） transgenic mouse model， which may be used for the research of the pathogenesis of atherosclerosis. MethodsRT-PCR and immunohistichemistry was used to detect 5-LO transgenic mice and control mice. The cholesterol and blood pressure was also detected. ResultExpression of 5-LO and 5-lipoxygenase activating protein （LFAP） were higher in the kidney and lung of the 5-LO transgenic mice than the control mice. The results of RT-PCR showed that the expression of leukotriene and its receptor were higher in the bone marrow cells， peritoneal cells， spleen and kidney of the 5-LO transgenic mice than the control mice. Compared the 5-LO transgenic mice with the control mice， there were significant differences in the expression of LTA4， LTB4 and Cys-LTR2 in the bone marrow cells and peritoneal cells （P＜0.05）， there were significant differences in the expression of LTB4， LTC4 and Cys-LTR2 in the spleen and kidney （P＜0.05），there was a significant difference in the expression of Cys-LTR1 in the kidney （P＜0.05）， there were significant differences in the expression of CRP， IL-1β， PDGF and NF-κB in the kidney （P＜0.05）. The result of blood pressure determination showed that it was higher in the 5-LO transgenic mice than the control mice （P＜0.05）， and there was no significance in the cholesterol （P＞0.05）. ConclusionThe 5-LO transgenic mouse model has been established.

5-lipoxygenase（5-LO）； Atherosclerosis； Transgenic mice

Q95-33

A

1674-5817（2015）04-0265-06

10.3969/j.issn.1674-5817.2015.04.001

2015-05-31

辽宁省高校科研项目计划（2008S239）； 辽宁省科技计划项目（2008408002-2， 2014408001）

张梅英（1965-）， 女， 研究方向: 实验动物转基因。E-mail: zhmeiying@163.com

郑志红。E-mail: zhihongzheng@163.com