猪圆环病毒2型培养条件优化试验

张爽

（辽宁省锦州市动物疫病预防控制中心，辽宁 锦州 121000）

猪圆环病毒2型培养条件优化试验

张爽

（辽宁省锦州市动物疫病预防控制中心，辽宁 锦州 121000）

猪圆环病毒（Porcine circovirus，PCV）是近年来新发现的一种猪的传染病，主要感染仔猪或青年猪。主要临床表现为断奶仔猪多系统衰竭综合征、猪呼吸道疾病综合征、猪皮炎与肾炎综合征、母猪繁殖障碍、肉芽肿性肠炎、坏死性淋巴结炎。防控猪圆环病毒病的最佳手段是疫苗免疫，病毒的毒价与疫苗的免疫原性关系密切，本试验从病毒接种剂量、D-氨基葡萄糖浓度和病毒培养时间等方面优化培养条件，提高病毒培养液的毒价，为研制猪圆环病毒2型疫苗奠定基础。

1　材料与方法

1.1细胞及病毒

PK15细胞：中国兽医药品监察所猪圆环病毒：自行分离鉴定

1.2病毒含量的测定

将病毒液用2%牛血清MEM做10倍系列稀释，取104、105、1063个稀释度，每个稀释度接种96孔细胞培养板培养的PK-15细胞各5个复孔，在37℃条件下培养，用IFA方法进行染色，计算TCID50

1.3病毒繁殖条件的优化

1.3.1病毒接种剂量本试验采用同步接毒法，分别按1%、2%、3%、5%和10%剂量同步接种PK-15细胞，同时在培养液中添加3mmol/L D-氨基葡萄糖，置于37℃培养，144h后收毒，将收获的病毒液反复冻融3次，3000r/min，离心10min，取上清液，测定毒价，确定最佳接毒剂量。

1.3.2D-氨基葡萄糖浓度的确定本试验按5%剂量同步接种 PK-15细胞，分别添加终浓度为 0、0.5mmol/L、1 mmol/L、3mmol/L、6mmol/L、8mmol/L的D-氨基葡萄糖，置于37℃培养，144h后收毒，将收获的病毒液反复冻融3次，3000r/min，离心10min，取上清液，测定毒价，确定D-氨基葡萄糖的最佳浓度。

1.3.3病毒的最佳收毒时间的确定按5%剂量同步接种PK-15细胞，培养液中加入终浓度为3%的D-氨基葡萄糖，置于37℃培养，分别于0h、24h、48h、72h、96h、120h、144h、168h收获病毒液，反复冻融3次，3000r/min，离心10min，取上清液，测定毒价，确定病毒的最佳收获时间。

2　结果

2.1病毒接种剂量

表1　不同接种剂量的毒价结果

由表1可以看出，病毒接种剂量在1%～5%时，随着接种剂量的增加，病毒的毒价也增加，当病毒接种剂量达到5%时，病毒含量为106.6 TCID50/mL。当病毒接种量达到10%时，病毒含量只为106.0TCID50/mL。由此可见，确定以5%毒种剂量接种细胞繁殖病毒。

2.2D-氨基葡萄糖浓度的确定

表2　不同D-氨基葡萄糖浓度病毒液的毒价结果

由表2可以看出，D-氨基葡萄糖浓度在0～3mmol/L时，病毒的毒价随着D-氨基葡萄糖浓度的升高而升高，当D-氨基葡萄糖浓度超过3mmol/L时，病毒毒价逐渐下降，因此，在培养液中添加3mmol/LD-氨基葡萄糖时，最适合病毒增值。

2.3病毒的最佳收毒时间的确定

表3　不同培养时间下病毒液的毒价结果

由表3可以看出，在接种后144h收获病毒液，病毒的毒价最高。当培养至168h时，病毒液的毒价降至105.3TCID50/mL。因此，最佳收获时间确定为144h。

3　讨论

疫苗免疫是防控猪圆环病毒病的最佳手段，病毒毒价的高低影响着疫苗的免疫效果。探索最佳的接毒剂量，既节约成本，又有效的提高病毒液的毒价。猪圆环病毒2型（PCV2）生物学特性比较特殊，在PK-15细胞中增殖的滴度不高，在病毒培养液中加入适量的D-氨基葡萄糖有利于病毒的复制，确定D-氨基葡萄糖加入浓度，可以有效的提高病毒的毒力。但对其作用的机制尚不清楚。另外，掌握好病毒培养的时间，能有效降低病毒毒力的损耗。综合上述因素，本试验对猪圆环病毒2型培养条件进行了优化，按5%终浓度同步接种PK-15细胞，在培养液中加入3mmol/mL的D-氨基葡萄糖，置于37℃培养，144h后收毒，测定的病毒含量最高。

10.3969/J.ISSN.1671-6027.2015.07.024