烟曲霉YSITB I菌株筛选及其降解木质纤维中木质素研究

袁俊超等

摘要：天牛幼虫肠道菌群具有分解木质纤维的功能。本研究以木质纤维为唯一碳源，从天牛幼虫肠道中筛选出三株对木纤维具有降解能力的菌株，对其中的烟曲霉YSITB I菌株降解木纤维中木质素能力及降解条件进行研究，并对三种菌株降解木纤维中木质素的协同作用进行了初步观察。结果显示，烟曲霉YSITB I菌株具有较好的木质素降解作用，在30 ℃、pH值6.8条件下，对构树木质纤维中木质素的降解率可达56.9%；枯草芽孢杆菌YSITBII和烟曲霉YSITB I协同作用可提高木质素降解效率至64.8%；烟曲霉YSITB I 15d降解木纤维效率高于40%。烟曲霉对木质纤维的降解作用达到甚至高于模式菌-黄包原毛平革菌，降解木纤维程度较高，用于木质纤维脱木质素或秸秆降解沤肥具有很好的应用前景。

关键词：木质素；天牛幼虫；pH；温度；协同性；烟曲霉菌；沤肥

中图分类号：S182 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2015）17-4164-04

天牛成虫在树木表皮上蛀槽或钻洞产卵，卵孵化出幼虫后即蛀入树干，最初在树皮下取食，待龄期增大后，即钻入木质部，在树干内越冬，通常可在树干内生活3～4个月甚至1～2年，以蛀食木质部为生。其消化肠道是一个复杂的生态系统，栖息着大量的微生物。这些微生物对宿主起着非常重要的作用，其中某些种类可能具有分解木质纤维中的木质素的能力[1-3]。本项目拟从天牛幼虫肠道菌群中分离筛选具木质素降解功能的菌株，探讨其降解木质素作用条件、降解效率以及影响因素，用于木质纤维的再利用脱木质素或废弃木材和秸秆等的降解[4，5]。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 材料 天牛幼虫：2014年3月采自湖北咸宁蔡家岭林场杨树树干。烟曲霉（Aspergillus fumigatus）YSITB I菌株、枯草芽孢杆菌YSITB Ⅱ菌株、蜡样芽孢杆菌YSITB Ⅲ菌株，由本试验分离筛选自天牛幼虫肠道。黄孢原毛平革菌（Phanerochaete chrysosporium）（CICC14076），由中国工业微生物菌种保存中心提供。木纤维是构树根提取黄酮后的残渣，脱脂脱蛋白，低温烘干，粉碎，浅黄色粉末。

1.1.2 培养基 PDA培养基：牛肉膏蛋白胨培养基。木纤维液体培养基：构树木纤维0.500 0 g，KH2PO4 0.215 0 g，（NH4）2SO4 0.216 0 g，MgSO4 0.007 3 g，CaCl2 0.015 0 g，加去离子水溶解至50 mL。木纤维固体培养基：在木纤维液体培养基基础上加入4.5 g琼脂，加热融化。每种培养基均在121 ℃下灭菌20 min。

1.1.3 主要试剂和仪器 木质素（GR荷兰DUCHEFA公司）、蒽酮（AR国药集团化学试剂有限公司）、溴乙酰（AR国药集团化学试剂有限公司）。紫外分光光度计（上海精密科学有限公司UV759），倒置荧光显微镜（OLYMPUS IX71）

1.2 方法

1.2.1 菌株的分离、纯化及筛选 取天牛幼虫一条，以75%的乙醇清洗，显微镜下取出肠道，加2 mL无菌水匀浆，梯度稀释至10-8，分别取10-6、10-7、10-8三个梯度匀浆悬液200 μL涂布于木纤维固体培养基上，每个浓度梯度重复3次。37 ℃培养，隔天观察。取各种不同单菌落再涂布于木纤维固体培养基上，在同样条件下进行2次纯化培养。选择生长良好的菌落进行液体培养，观察各菌落对木质纤维的降解作用。

1.2.2 菌株形态观察及鉴定 对生长较好的3种主要菌株进行菌落、菌丝及菌细胞观察，真菌做ITS序列鉴定，细菌做16S序列鉴定。

1.2.3 烟曲霉YSITB I菌株降解木纤维观察 选取其中生长较好的1种菌株（编号为YSITB I，经鉴定为烟曲霉）作进一步降解木纤维作用观察。取直径约5 mm 烟曲霉YSITB I菌落1个，加2 mL灭菌水充分震荡制成菌悬浮液。每30 mL木纤维液体培养基中接入200 μL菌悬液，橡胶塞塞紧，设为试验组。另取30 mL木纤维液体培养基，接入200 μL无菌水，作为空白对照组，每组平行接种3瓶，在恒温空气摇床30 ℃、100 r/min下培养。观察记录菌落生长及木纤维降解情况。

1.2.4 烟曲霉YSITB I菌株降解木质素条件选择 温度按1.2.3中试验方法和用量接种烟曲霉YSITB I，分别在10 ℃（室外）、15 ℃（室内）、30 ℃、40 ℃、50 ℃共5个温度条件下培养，每隔3 d取出200 μL培养液，用硫酸-蒽酮法[6]检测溶液还原糖含量，共观察15 d。最后，培养液过滤、洗涤、烘干，得木纤维残渣，称重，用溴乙酰法[7-9]测量木质素含量。以黄孢原毛平革菌作对照进行同样的培养和处理。按下式计算木质素降解率。

木质素降解率=残渣中木质素总量/原料中木质素总量×100%

天牛幼虫肠道液pH约6.5，观察不同pH对烟曲霉降解木质素的影响。以NaH2PO4-Na2HPO4缓冲系配制木纤维液体培养基，pH分别调为5.9、6.2、6.5、6.8、7.1，按1.2.3中试验方法和用量接种烟曲霉YSITB I，按以上取样方法进行检测。以黄孢原毛平革菌作对照进行同样的培养和处理。

1.2.5 烟曲霉YSITB I菌株与两种细菌菌株的协同降解木质素作用 将烟曲霉YSITB I与枯草芽孢杆菌和蜡样芽孢杆菌按下述方式组合，接种至30 mL木纤维液体培养基中，按1.2.3中试验方法处理培养。按1.2.4.取样方法进行检测。组合①，200 μL的烟曲霉YSITB I菌液；组合②，100 μL的烟曲霉YSITB I菌液+100 μL的枯草芽孢杆菌菌液；组合③，100 μL的烟曲霉YSITB I菌液+100 μl的蜡样芽孢杆菌菌液；组合④，100 μL的烟曲霉YSITB I菌液+50 μL的枯草芽孢杆菌菌液+50 μL的蜡样芽孢杆菌菌液。

2 结果与分析

2.1 菌株筛选与鉴定

以木纤维固体培养基从天牛幼虫肠道中分离筛选出3株长势良好的菌株（图1），分别为YSITB I、YSITB II和YSITB III。YSITB I：棉花样，开始为白色，2～3 d后转为绿色，数日后变为深绿色，呈粉末状。YSITB II：圆点状，乳白色，菌落大小不一，向上凸起。YSITB III：菌落较大，不透明，表面粗糙似毛玻璃状或蜡状，边缘放射状扩散。图2a为菌丝在木纤维上的生长情况，菌丝包裹木纤维颗粒生长，基部伸入纤维颗粒内部，第二天开始出现孢子囊，孢子囊呈烧瓶状，小梗单层，由多列菌丝排列成栅栏状，顶端有链形分生孢子，分生孢子球形，有小棘，呈绿色，如图2b所示。经ITS序列鉴定，YSITB I为烟曲霉，YSITBⅡ和Ⅱ和YSITBⅢ经16S序列鉴定，分别为枯草芽孢杆菌和蜡样芽孢杆菌。图3是烟曲霉YSITB I的进化树。

2.2 烟曲霉YSITB I降解木纤维观察

图4a示烟曲霉YSITB I在木纤维液体培养基生长形成的菌丝团，培养至第二天时菌丝团直径可达6 cm，纤维颗粒被菌丝包裹，溶液变得澄清透明，基本见不到明显的木纤维颗粒；空白木纤维培养基在整个培养过程中无明显变化，如图4b。

2.3 烟曲霉YSITB I在不同条件下对木纤维的降解作用

2.3.1 温度的影响 由表1可知，在考察的温度范围内，烟曲霉YSITB I对木纤维中木质素的降解率先随温度升高而增大，30 ℃时达到最大降解率45.1%，随后随温度升高降解作用减小。黄孢原毛平革菌在温度为15 ℃时，木质素的最大降解率为39.2%，烟曲霉YSITB I对木质素的最大降解率比黄孢原毛平革菌高出5.9个百分点。

对纤维素的降解作用以培养液中还原糖的变化表示，如图5所示。温度在30 ℃和40 ℃时，培养液中还原糖的含量较低，这应是两种作用的共同结果，一方面菌株生长过程中分泌的酶降解纤维素和半纤维素等物质使糖含量不断升高，另一方面菌株生长不断消耗糖，其一阶段糖的生产量高于糖的消耗量，培养液中糖含量不断增加，至第九天二者达到平衡，之后随着菌株不断生长，糖消耗量超过糖的生产量，培养液中糖含量下降。50 ℃时培养液中还原糖含量随时间逐渐下降，这可能提示较高温时，酶活性下降。低温时糖含量变化没有明显趋势。

2.3.2 pH的影响 由表2可知，烟曲霉YSITB I在pH 6.8时，木质素降解率最大，达56.9%，接近黄孢原毛平革菌的最大降解率60.3%，其他pH条件下，木质素降解效率相差不明显。培养液中还原糖含量的变化如图6所示，总体上呈现出先升高后下降的趋势，至第九天达最大值，其中pH 6.8和pH 7.1时，还原糖含量较低，明显低于其它pH条件下的含量。

2.4 不同菌株对木质素的协同降解作用

由表4可知，烟曲霉YSITB I+枯草芽孢杆菌协同降解木质素的效率达64.8%，比烟曲霉YSITB I单独降解木质素效率高出18.6个百分点，也明显高于其他两种组合的降解率，说明烟曲霉YSITB I与枯草芽孢杆菌组合对木质素的降解具有一定的协同性。但这种作用需要做进一步观察研究。烟曲霉YSITB I+蜡样芽孢杆菌协同降解对含菌丝体木纤维的降解率为41.0%，比烟曲霉YSITB I单独降解木质纤维高出1个百分点，也明显高于其他两种组合的降解率。说明烟曲霉YSITB I与蜡样芽孢杆菌对木纤维的降解具有一定的协同性。但这种协同作用是否与应用沤肥有关，有待进一步的研究。

3 讨论

本试验筛选出的烟曲霉是天牛幼虫肠道微生物菌群之一。烟曲霉是一种腐生真菌，是人类肺部的主要真菌病原体[10]。近来，许多微生物学家和环保学家正在研究利用烟曲霉对色素的降解作用和利用烟曲霉菌丝的吸附作用[11]治理污水。霉菌能降解色素、石油等有机物污染物主要是因为分泌的酶[12，13]的作用。黄孢原毛平革菌是降解木质素的模式菌，但近些年来被用作降解色素[14]。烟曲霉也含有降解色素的酶，烟曲霉曾被用作降解植物细胞壁[15]，细胞壁含有丰富的木质素[2]。综上所述，烟曲霉能降解木质素具有一定的依据。

温度和pH条件是菌种生长的不可缺少的因素。本试验通过对烟曲霉木质素降解率的测定，得出了30 ℃为烟曲霉的最适温度，6.8 pH为最适酸碱度，符合普遍真菌的生长温度和pH值。

4 结论

为寻找木质素降解菌，本研究从天牛幼虫肠道中分离出3种可利用木纤维作碳源的菌株，其中烟曲霉YSITB I具有明显的降解木质素作用，在pH 6.8、温度30 ℃条件下，对木纤维中木质素的降解率可达56.9%。烟曲霉+枯草芽孢杆菌的协同降解木质素作用要好于烟曲霉单独对木质素的降解作用，其降解木质素效率要高出18.6个百分点；烟曲霉YSITB I+蜡样芽孢杆菌协同降解木纤维的效率达41.0%。通过烟曲霉和黄孢原毛平革菌降解木质素两个因素的影响下的阳性对照，在误差允许的范围内，烟曲霉对木质素的降解作用和黄孢原毛平革菌的基本持平。所以烟曲霉用于木质纤维脱木质素或秸秆降解沤肥具有很好的应用前景。

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