不同合金烤瓷冠修复后龈下菌斑中牙龈卟啉单胞菌的变化

张　蕾，茹菲亚·祖拉提，何惠宇，迪丽努尔·阿吉，胡　杨

（新疆医科大学第一附属医院口腔修复科新疆乌鲁木齐830054）

不同合金烤瓷冠修复后龈下菌斑中牙龈卟啉单胞菌的变化

张蕾，茹菲亚·祖拉提，何惠宇，迪丽努尔·阿吉，胡杨

（新疆医科大学第一附属医院口腔修复科新疆乌鲁木齐830054）

目的：研究使用不同合金烤瓷冠修复后龈下菌斑中牙龈卟啉单胞菌的变化。方法：选择门诊患者行下颌第一磨牙全冠修复共60例，随机分入两组不同合金烤瓷冠组，分别在戴入前，戴入后1个月、3个月检查龈沟出血指数，并且采用荧光定量聚合酶链反应测定龈下菌斑中牙龈卟啉单胞菌的变化。结果：比较修复前，钯银合金组的龈沟出血指数在修复后1个月、3个月无明显升高（P＞0.05）；而钴铬合金组的龈沟出血指数在修复后1个月、3个月有较明显升高（P＜0.05）；与修复前比较，钯银合金组的牙龈卟啉单胞菌相对定量值在修复后1、3个月无明显增加（P＞0.05）；钴铬合金组在修复后1个月、3个月的牙龈卟啉单胞菌相对定量值有明显增加（P＜0.05）。结论：两种合金材料的烤瓷冠修复后对患者牙龈有一定的影响；其中钴铬合金影响明显大于钯银合金。

烤瓷冠；牙龈卟啉单胞菌；荧光定量聚合酶链反应

自20世纪70年代烤瓷熔附金属全冠引进中国以来，其已成为临床上最常用的修复体之一。研究表明，修复体材料的不同对基牙牙周组织的影响不同［1］。因此探究何种合金的烤瓷冠对患者牙周组织影响较小显得尤为重要。牙龈卟啉单胞菌是证据充分的牙周致病菌之一，并与慢性牙周炎的关系最为密切［2］。本实验选择行不同合金烤瓷冠修复患者，使用实时荧光定量PCR技术检测龈下菌斑中牙龈卟啉单胞菌数量的变化，以期为临床工作做一指导。

1　材料和方法

1.1病例选择

选择2013年12月-2014年2月就诊于新疆医科大学第一附属医院口腔修复科，需行下颌第一磨牙全冠修复的患者共60例，年龄20～50岁，随机分为钯银组和钴铬组，每组30人。采用自身前后对照的方法，将患者备牙前的受试牙设为对照组，冠修复后的受试牙设为试验组。

纳入标准：患者牙列完整，咬合正常，无扭转，无颊舌侧倾斜、伸长；基牙牙周健康，牙龈色泽正常，探诊无出血。可以配合复诊。

排除标准：患有可能影响牙周组织的全身疾病；实验前3个月或实验过程中，患呼吸系统疾病者或口腔软硬组织疾病者；妊娠期妇女；对金属材料过敏患者；无合作意愿的患者；其他一切修复治疗的禁忌症。

牙体预备标准参见《口腔修复学》第6版［3］，所有基牙肩台制备：龈下0.5mm，宽度1mm，并且光滑连续。修复体粘结选用统一粘结剂。

1.2材料

1.2.1烤瓷冠材料：钯银合金：由义获嘉韦瓦登特公司生产，主要成分钯59.2%，银27.9%；钴铬合金：由德国拜高公司生产，主要成分钴61.2%，钴26.3%。1.2.2细菌菌种：牙龈卟啉单胞菌ATCC33277由武汉大学口腔医学院实验室提供。

1.2.3试剂：细菌基因组DNA提取试剂盒（天根生化科技有限公司，北京），细菌基因组DNA提取试剂盒（天根生化科技有限公司，北京）；2*TaqPCR MasterMix（天根生化科技有限公司，北京）；琼脂糖（Biowest，Hongkong）；Maxima SYBR Green qPCR Master Mix（Thermo，American）；核酸染料（北京博迈德生物工程公司）；无水乙醇（南京奥佳化工有限公司）；MarkDL 1200、MarkDL 2000（天根生化科技有限公司，北京）；BHI培养基、TBE电泳缓冲液均由自行配置而成。

1.2.4引物：根据相关文献设计引物［4］及细菌通用引物［5］，引物均由上海生工生物工程股份有限公司合成。1.3方法

1.3.1牙周临床指标检测：分别在基牙修复前、修复后1个月和修复后3个月检查牙周临床指标，由同一名医生完成临床操作并且记录龈沟出血指数（SBI）。SBI根据《牙周病学》第2版描述的方法进行检测［6］。

表1　PCR引物和探针序列

1.3.2临床样本采集：牙体预备前嘱患者清水漱口1分钟。采集部位以棉卷隔湿，使用无菌龈下刮治器取基牙舌侧的龈下菌斑，立即置入含1mlPBS的EP管内，冰浴下转送实验室并于-20℃冰箱内冻存备用。

1.3.3标准菌株：牙龈卟啉单胞菌ATCC3327737℃厌氧复苏48h，各自挑选1个单菌落行次代培养（牛心脑液培养基），厌氧条件下（37℃，24h）用生理盐水分别洗菌，用于DNA提取。

1.3.4DNA的制备：牙龈卟啉单胞菌的DNA提取方法均参照细菌基因组DNA提取试剂盒的操作步骤进行。-20℃保存备用。

1.3.5标准品的制备：将提取备用的牙龈卟啉单胞菌DNA用无菌水连续5倍稀释，共稀释7个梯度，即：101，10-1，10-2，10-3，10-4，10-5，10-6，10-7，备用。

1.3.6实时荧光定量PCR的定量检测：使用配制好的标准品，进行牙龈卟啉单胞菌及内参基因标准曲线的制备。将稀释后的临床样本DNA进行荧光定量PCR检测，并得到相应的CT值结果。荧光定量PCR的总反应体系为20μl：细菌标准品或样本的DNA 2μl，上游引物0.5μl，下游引物0.5μl，SYBR mixture 10μl，灭菌ddH2O 7μl。设置循环参数如下：预处理95℃10min；变性95℃15s；退火60℃30s；延伸72℃30s，共进行39个循环周期。所有反应均在Bio-Rad荧光定量PCR仪（Bio-Rad，美国）上进行，每个样本检测均设副管，并取其平均值，每次反应均设空白对照。将得到的PCR扩增产物进行凝胶电泳实验，以验证结果的准确性。

1.4统计分析

采用SPSS 17.0软件进行统计学分析，P＜0.05认为有统计学意义。修复前与修复后1个月、修复前与修复后3个月的荧光定量值的比较采用配对t检验。

2　结果

2.1统计结果

钯银、钴铬合金烤瓷冠两组修复前与修复后1个月、3个月的SBI（见表2），钯银合金组没见明显差异（P＞0.05）；而钴铬合金组的龈沟出血指数在修复后1个月、3个月有较明显升高，差异有统计学意义（P＜0.05）；钯银、钴铬合金烤瓷冠两组修复前与修复后1个月、3个月的P.gingivalis相对定量结果（见表3），与修复前比较，钯银合金组1个月、3个月的牙龈卟啉单胞菌相对定量值无明显增加（P＞0.05）；钴铬合金组1个月、3个月的牙龈卟啉单胞菌相对定量有明显值增加，差异有统计学意义（P＜0.05）。

表2　两组修复前后SBI（±s）

表2　两组修复前后SBI（±s）

注：与修复前比较，钯银合金组的龈沟出血指数在修复后1个月、3个月无明显升高（P＞0.05）；而钴铬合金组的龈沟出血指数在修复后1个月、3个月有较明显升高（P＜0.05）

组别钯银合金组钴铬合金组例数30 30 0个月0.24±0.49 0.27±0.46 1个月0.71±0.15 1.37±0.51 3个月0.56±0.21 1.27±0.38

表3　钯银合金组与钴铬合金组冠修复后P.gingivalis相对定量结果（±s）

表3　钯银合金组与钴铬合金组冠修复后P.gingivalis相对定量结果（±s）

注：与修复前比较，钯银合金组1个月、3个月的牙龈卟啉单胞菌相对定量值无明显增加（P＞0.05）；钴铬合金组1个月、3个月的牙龈卟啉单胞菌相对定量值有明显增加（P＜0.05）

组别钯银合金组钴铬合金组例数30 30 2-△△CT 0个月1±0 1±0 1个月1.12±0.15 1.93±0.71 3个月1.09±0.13 1.55±0.46

2.2牙龈卟啉单胞菌及内参基因的标准曲线标曲图

本实验通过对引物及反应条件的不断优化，使得牙龈卟啉单胞菌及内参基因的扩增效率基本达到一致，可以用相对标准曲线法对样本中牙龈卟啉单胞菌的表达进行相对定量分析（如图1、图2）。

2.3临床样本real-time PCR结果检验

将样本进行实时荧光定量检测之后行电泳试验，电泳图显示产物均为单一亮带，未见引物二聚体。

图1　牙龈卟啉单胞菌标准曲线图

图2　样本牙龈卟啉单胞菌q-PCR产物电泳图

图3　样本内参基因q-PCR产物电泳图

3　讨论

烤瓷熔附金属全冠作为目前临床中最常见，也是固定义齿修复的主要的修复方式。随着口腔材料学的不断发展和口腔加工工艺的不断改进，很多贵金属材料已应用于烤瓷冠的加工，逐步取代原先使用的非贵金属材料。

烤瓷熔附金属全冠对于牙周组织的影响是多因素造成的，如：全冠采用的材料、冠边缘的位置、形态、所用的粘结剂等等［7］。口腔环境潮湿，复杂，在各个部位存在大量的细菌，但不是存在细菌就会引起牙周的病变，细菌和宿主间存在动态的平衡。正如烤瓷冠的介入打破了这种平衡就会引起微生态的失调，细菌粘附增多，牙周组织遭到破坏。临床中可以通过龈沟液的变化、龈沟出血指数等客观反应牙龈的变化。而口腔微环境变化的进一步研究有待于实验室研究。牙龈卟啉单胞菌是公认的牙周可疑致病菌之一，与牙周炎的始动因子、趋化密切相关。

本研究选择龈沟出血指数作为临床牙周指标，从宏观上观察患者在戴入不同合金烤瓷冠前后牙周组织的变化；并且为进一步研究，微观上选择目前准确度较高的实时定量PCR法进行检测牙龈卟啉单胞菌相对定量的变化。旨在多角度评估不同金属内冠的烤瓷冠在牙周组织方面的影响，以期为临床提供更好的指导。

烤瓷熔附金属全冠最早期在临床中的应用多为镍铬合金，随着口腔材料的不断发展，现在已被钴铬合金、钯银合金、纯钛等替代。

钴铬合金具有良好的机械性能、低廉的成本，作为非贵金属应用于齿科修复材料。它较镍铬合金有较好的生物相容性，稳定性。李宏洋［1］等通过研究认为钴铬合金对牙周组织的不利影响是客观存在的。钯银合金是仅次于金合金，广泛应用的贵金属齿科修复材料。它生物相容性好，抗腐蚀性强，对牙周组织刺激小，是烤瓷合金中理想的材料。故本研究选取这两种临床最常用的合金烤瓷冠的基牙为研究对象。

金属材料对牙周的影响主要是材料在口腔环境中发生腐蚀，牙周问题成为临床导致修复失败的原因［8］。有研究发现钴铬合金能刺激人单核细胞合成和释放肿瘤坏死因子，诱发单核细胞凋亡，引起周围组织炎症［9］。

本研究中修复体边缘设计在牙龈下0.5mm，肩台充分抛光；选取同一种粘结剂。是为了避免全冠边缘对牙龈的刺激，尽量减少干扰因素。实验结果显示牙龈出血指数在戴入修复体后1个月、3个月，钯银合金组较戴入前无明显差异，而钴铬合金组却有明显升高，故钯银合金组优于钴铬合金组；实时定量PCR试验中牙龈卟啉单胞菌相对定量结果也同前。说明烤瓷冠修复后对患者牙龈是有一定的影响，但是这种影响不一定是致病性的影响。钯银合金性能优于钴铬合金。这与诸位学者［1，10］研究结果一致。实验结果显示戴入修复体后3个月同1个月相比无明显差异，且有下降趋势。笔者分析，患者戴入修复体1个月时，口腔微环境动态平衡被打乱，需要一定时间恢复，故在3个月时趋于稳定。此推测需进一步证实。可增大样本量，延长观察时间，可能会得出具有统计学意义的结果。

［1］李洪洋，钟丽芳，刘兵，等.钴铬合金及钯银合金烤瓷冠对牙周组织的影响［J］.中国组织工程研究，2013，17（21）：3893-3900.

［2］Socransky SS，Haffajee AD.The bacterial of destructive periodontal disease：Current concepts［J］.J Periodontol，1992，63（4 Suppl）：322-331.

［3］赵铱民.口腔修复学［M］.6版.北京：人民卫生出版社，2011：73-74.

［4］陆卉，周慧敏，宋晓波.成人正畸患者龈下菌斑中牙龈卟啉单胞菌的变化［J］.华西口腔医学杂志，2010，28（2）：166-169.

［5］刘芳，冯锦虹，仵楠，等.维吾尔族和汉族不同龋敏感儿童远缘链球菌的荧光定量PCR检测［J］.新疆医科大学学报，2013，36（4）：494-499.

［6］曹采方.牙周病学［M］.2版.北京：人民卫生出版社，2004：87-90.

［7］孟焕新.牙周病学［M］.3版.北京：人民卫生出版社，2008：118-120.

［8］Al-Salehi SK，Hatton PV，Johnson A.et al.The effect of hydrogen peroxide concentration on metal ion release from dental casting alloys［J］.J Oral Rehabil，2008：35（4）：276-282.

［9］Lopez-Alias JF，Martinez-Gomis J，Anglada JM，et al.Ion releasefromdentalcastingalloysasassessedbya continuousflowsystem：Nutritionalandtoxicological implications［J］.Dent Mater，2006：22（9）：832-837.

［10］谭荣.固定修复对于牙周组织健康状况的影响［J］.口腔医学研究，2014，10（10）：970-973.

编辑/张惠娟

Quantitative study on P.gingivalis on different alloy porclain crown

ZHANG Lei，Rufiya·Zulati，HE Hui-yu，Dilinuer·Aji，HU Yang
（Department of Prosthodontics，The First Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University，Urumqi 830054，Xinjiang，China）

Objective To investigate the variation of P.gingivalis influenced by different alloy porclain crown.Methods A total of 60 patients，need restoration treatment of mandibular first molar by PFM crown，they were all randomly chosen to participate in two groups-sliver-palladium alloy porclain group or cobalt-chromium alloy porclain group that each one is 30 petients.We used Polymerace Chain Reaction to have quantitative determination for P.gingivalis，and check up the SBI before and after restoration one and three months.Results Compared with those before restoration.The SBI of one and three months after restoration in the cobalt-chromium alloy porclain group is higher（P＜0.05）while in the sliver-palladium alloy porclain group is not changed（P＞0.05）.Also the same results turn out in the quantities of P.gingivalis after Poly-merace Chain Reaction.Conclusion PFM crowns may have some effects on variation of P.gingivalis.The sliver-palladium alloy porclain is better than the cobaltchromium alloy porclain.So the sliver-palladium alloy is an ideal substrate material of PFM crown.

PFM crown；Porphyromonas gingivalis；Poly-merace Chain Reaction

R783.3

A

1008-6455（2015）15-0038-04

新疆医科大学第一附属医院院级青年科研专项基金（项目编号：2012QN03；新疆维吾尔自治区科技厅自然科学基金（项目编号：2014211C037）

胡杨，汉族，主治医师；研究方向：组织工程骨构建；E-mail∶joe98344@126.com

2015-06-08

2015-07-30