不同产地山羊角凝胶电泳指纹图谱及其混伪品鉴别研究△

康馨元，刘睿，李春楠，孙佳明，张辉*

(1.长春中医药大学，吉林 长春 130117；2.南京中医药大学，江苏 南京 210046)

不同产地山羊角凝胶电泳指纹图谱及其混伪品鉴别研究△

康馨元1，刘睿2，李春楠1，孙佳明1，张辉1*

(1.长春中医药大学，吉林 长春 130117；2.南京中医药大学，江苏 南京 210046)

目的：研究建立不同产地山羊角药材的十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)的指纹图谱以及与混伪品的鉴别方法。方法：采用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法对山羊角及其伪品的蛋白成分进行分析比较。结果：不同产地山羊角电泳图谱相似，有5个共有带峰，可作为山羊角的专属条带。结论：该方法简单易行、灵敏度高，可为山羊角的产地鉴别及与伪品的鉴别提供参考。

山羊角；十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳；指纹图谱

山羊角为牛科动物青羊NaemorhedusgoralHardwicke的角。其首载于《本草新编》，曰：“专活死血”[1]。山羊角味咸，性寒。无毒。具有清热、镇惊、散瘀止痛等功能。其成分主要有甾族、磷脂类、角蛋白、水溶性蛋白、多肽及氨基酸类成分[2-5]。《医林纂要》记载“功用近羚羊角”。山羊角和羚羊角化学成分及药理作用基本相同，均有解热、镇静、催眠作用，山羊角的镇静作用稍强[6]。由于羚羊角数量稀少，药材主要靠进口，故山羊角是羚羊角的理想替代品[7]。因此，本试验收集10批不同产地山羊角样品，采用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)法，通过凝胶电泳图像分软件和中药指纹图谱相似度软件，进行了山羊角蛋白SDS-PAGE指纹图谱研究，并与绵羊角、水牛角、牛蹄甲进行对比，旨在建立一种快速、简便的山羊角专属性鉴定方法，为山羊角药材的鉴别及质量评价、与羚羊角蛋白质类的成分对比研究提供参考。

1 仪器与材料

1.1 仪器

DYY-10C型电泳仪、DYCZ-24DN型垂直电泳槽(北京市六一仪器厂)；TGL-16B型低速离心机(上海安亭科学仪器厂)；BSA124S-CW电子天平、酸度计(赛多利斯科学仪器有限公司)；DSHZ-300A旋转式恒温振荡器(太仓市实验设备厂)；FD-1000真空冷冻干燥装置(日本)；HS2060型超声波清洗器(HENGAO T&D)；WP-UP-III-40超纯水系统(四川沃特尔科技发展有限公司)。

1.2 试剂

丙烯酰胺(AMRESCO)；N-N甲叉双丙烯酰胺、三羟甲基氨基甲烷(北京鼎国生物公司Genview分装)；过硫酸铵(北京鼎国生物公司 Sigma分装)；考马斯亮蓝G-250(北京鼎国生物公司)；Marker(TIANGEN)；β-巯基乙醇(Sigma)；TEMED(AMRESCO)；磷酸氢二钠、甲醇、乙酸、盐酸(北京化工厂)；去离子水。

1.3 材料

山羊角药材来源于浙江、河北、江苏、广东、黑龙江、内蒙古、安徽7省共10个地区，由东丰制药有限公司提供，由长春中医药大学中医药与生物工程研发中心张辉教授鉴定为牛科动物青羊NaemorhedusgoralHardwicke的角，见表1。伪品包括水牛角(吉林大药房)、牛蹄甲(吉林省敦化市)以及绵羊角(吉林省大安市)。

表1 山羊角药材来源

2 方法与结果

2.1 供试品溶液的制备

取10批山羊角以及伪品粉末各0.5 g，放入乳钵，分别加裂解液(含8 mol·L-1尿素，2 mol·L-1硫脲)5 mL，研磨20 min，成匀浆，置离心管中(3000 r·min-1)离心20 min，取上清液，冻干，备用[4]。

2.2 SDS-PAGE法测定

2.2.1 电泳 将配制好的试剂按所需丙烯酰胺比例，配制12%分离胶溶液，待分离胶聚合后，在其上方灌注5%浓缩胶溶液，并立即插入干净的样品梳，注意避免气泡产生。浓缩胶聚合完全后，小心移出样品梳，把凝胶固定于电泳装置上，上、下槽各加入Tris-甘氨酸电泳缓冲液。取样品冻干粉各约0.5 g，分别加入150 μL十二烷基硫酸钠(SDS)溶液(未加二硫苏糖醇)、20 μL巯基乙醇，加热煮5 min以使蛋白变性。按预定顺序加样，每份样品10 μL，由于供试品由尿素裂解液提取，变性后的样品在室温下极易凝固，故加样过程需快速完成。接上电源，调节电压(浓缩胶恒定电压为70 V，分离胶恒定电压为140 V)。样品在电流的驱动下向前移动，待移动到前沿处即可停止。

2.2.2 染色、脱色及凝胶保存 预先配制考马斯亮蓝染液，即在1 g考马斯亮蓝中分别加入200 mL甲醇、50 mL冰醋酸和250 mL水，混匀。用至少5倍体积的染色液浸泡凝胶，放在数显水浴恒温振荡器上，37 ℃平缓摇动，染色约4 h。将染色液替换成由甲醇-水-冰醋酸(9∶9∶2)配制成的脱色液，于数显水浴恒温振荡器上37 ℃平缓摇动，直至条带显现但凝胶底色还稍显蓝色时取出凝胶，保存于水中，浸泡2 d后置于凝胶成像分析系统上进行分析。

2.3 方法学考察

2.3.1 稳定性试验 取产于河北安国的山羊角药材按2.1方法制备供试品溶液，室温下放置，分别于0、1、2、4、6、12、24 h观察供试品溶液有无变化，并取样进行SDS-PAGE试验，考察主要共有蛋白带的一致性。结果表明，供试品中各主要共有蛋白带无缺失，在测定的24 h内稳定。

2.3.2 重复性试验 取同一批山羊角药材(河北安国)，按2.1方法分别制得5份供试品溶液，进行SDS-PAGE试验，考察主要共有蛋白带的一致性。通过LabWorks 4.6图像捕获/分析软件进行分析，再经origin软件积分峰面积，将数据导入到国家药典委员会的“中药指纹图谱相似度评价系统(2004A)”中进行相似度分析。结果表明，相似度为0.993～0.997，说明本方法重复性良好。

2.3.3 精密度试验 取同一批山羊角药材(河北安国)，按2.1方法制备供试品溶液，在同一块SDS-PAGE胶片上，取6次样品间隔上样，考察各共有蛋白带的相对距离漂移情况。通过LabWorks 4.6图像捕获/分析软件进行分析，再经origin软件积分峰面积，将数据导入到国家药典委员会的“中药指纹图谱相似度评价系统(2004A)”中进行相似度分析。结果表明，相似度为0.991～0.999，供试品进样精密度良好。

2.4 SDS-PAGE指纹图谱建立

2.4.1 对照指纹图谱及相似度分析 将10批样品及3批伪品的供试品溶液分别上样，得到不同样品蛋白的SDS-PAGE电泳胶片，见图1。大部分山羊角样品均明显出现5条蛋白带，相对分子质量分别约为63 KDa、60 KDa、55 KDa、51 KDa、46 KDa，其中60 KDa、46 KDa蛋白带浓度相对较高。胶片经凝胶分析软件生成图谱后，采用Origin7.5软件生成叠加图，见图2。将数据导入到国家药典委员会的“中药指纹图谱相似度评价系统(2004A)”得到样品的对照指纹图谱及伪品指纹图谱，见图3～6。国家药典委员会的“中药指纹图谱相似度评价系统(2004A)”软件将10批样品分别与对照图谱比较，相似度除河北保定、广东电白以及浙江绍兴外均在0.800～1.000之间。以生成的对照图谱为参照，计算得到伪品药材绵羊角、牛蹄甲以及水牛角指纹图谱，相对于对照图谱的相似度均低于0.600，见表2。

a.浙江金华；b.江苏盱眙；c.黑龙江鸡西；d.内蒙古阿拉善；e.河北安国；f.浙江缙云；g.安徽合肥；h.Marker；i.浙江绍兴；j.河北保定；k.广东电白；l.牛蹄甲；m.水牛角；n.绵羊角。图1 山羊角蛋白SDS-PAGE电泳胶片

注：1～10为不同产地山羊角样品。图2 10批山羊角样品SDS-PAGE指纹图谱叠加图

注：1.分子质量为63 KDa；2.分子质量为60 KDa；3.分子质量为55 KDa；4.分子质量为51 KDa；5.分子质量为46 KDa。图3 山羊角蛋白SDS-PAGE对照指纹图谱

图4 伪品绵羊角SDS-PAGE指纹图谱

图5 伪品牛蹄甲SDS-PAGE指纹图谱

图6 伪品水牛角SDS-PAGE指纹图谱

表2 10批样品及伪品相似度

2.4.2 特征指纹峰标定 在图和表中可看出5个特征峰的相对迁移率Rf值分别为0.443 5、0.465 6、0.520 4、0.563 7、0.612 3。通过分子质量标准蛋白得到相对迁移率(Y)与相对分子质量(X)关系的标准曲线方程：Y=-0.009 4X+1.038(r=0.878 2)，根据标准曲线，分别得到5个共有带峰的相对分子质量，见表3。将图3按照相对迁移率可分为两个区段：Rf值在0～0.540之间为第一区段，有1(63 KDa)、2(60 KDa)、3(55 KDa)三个蛋白带峰，峰1和峰2为相对强峰，峰3在不同产地样品图谱中略有不同；Rf值在0.540～1.000之间为第二区段，有三个蛋白带峰，但由于Rf值为0.800的蛋白带峰较为弥散，不能作为独立条带，考虑为相对分子质量较小的蛋白，有待将山羊角蛋白进行砍段处理后进一步研究，故本实验选择该区段内4(51 KDa)、5(46 KDa)两个蛋白带峰作为特征带峰，其中峰5为最强峰。

表3 SDS-PAGE凝胶电泳图像的5个特征带峰分析参数

3 讨论

SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳在分离蛋白质、多肽等大分子方面具有高分辨率、高灵敏度、分析时间短、用量少等特点[8]，又因其稳定性、精密度、重现性较好而被广泛应用[9]。本试验借助聚丙烯酰胺凝胶电泳技术对不同产地山羊角样品进行了分离，并采用凝胶分析软件与Origin软件相结合的方法，将样品电泳谱带生成更加直观的叠加图，以专属条带数目、蛋白质电泳Rf值、蛋白质丰度等作为综合评价指标，并通过相似度软件进行相似度分析，通过技术参数提供更可靠的鉴别依据。为保证该方法的准确性，本试验进行了方法学考察，结果表明SDS-PAGE电泳方法呈现良好的重复性、稳定性以及精密度。

从上述山羊角样品指纹图谱叠加图可见，10批不同产地山羊角的SDS-PAGE指纹图谱在谱带位置、条数、带型上无显著性差异；产自河北安国的样品有一特征谱带，说明河北安国山羊角的蛋白组成具有一定的产地差异；河北保定、广东电白以及浙江绍兴样品谱带清晰度低于其他产地样品，可能与样品有效成分含量不同有关。将样品图谱导入到相似度软件生成对照图谱，从中清晰可见5条共有条带，混伪品电泳图谱与之相比差异较为显著，因此可以将对照图谱所显示的5条特征条带作为山羊角专属条带，相对分子质量分别约为63 KDa、60 KDa、55 KDa、51 KDa、46 KDa。

本研究方法建立的指纹图谱可快速地对山羊角伪品与正品进行鉴别和区分，为山羊角药材质量评价及控制，进一步完善和深入研究山羊角药材的质量标准，与羚羊角蛋白质类的成分对比研究提供了参考依据。

[1] 孙宝森.动物角类的药用研究概况[J].中医药信息，2004，21(3)：25.

[2] 刘力，张辉，胡嵘，等.山羊角研究概述[J].长春中医学院学报，1994，10(5)：109.

[3] 杨清林，傅亚.山羊角提取物中氨基酸含量测定研究[J].中药材，2011，34(7)：1023-1026.

[4] 刘炎，张贵君，张杰，等.中药羚羊角及其类似品中水溶性蛋白的检测[J].中华中医药杂志，2009，24(12)：1571-1574.

[5] 李江海，王伯初，王建，等.山羊角提取物中焦谷氨酸含量测定研究[J].药物分析杂志，2011，31(8)：1567-1570.

[6] 李云谷.山羊角、黄羊角、羚羊角及其注射液的初步研究[J].草药通讯，1979(5)：12.

[7] XU B，ZHANG H.The advance-ment of antelope’s horn and its substitutes research[J].J Chin Med Mater，2003，26(12)：910.

[8] 李桂兰.苦杏仁及混伪品的可溶性蛋白质电泳鉴别[J].山西中医学院学报，2006，17(1)：50.

[9] 杭悦宇，张垂胜，史芸芸.西洋参和人参的可溶蛋白电泳鉴别[J].植物资源与环境学报，2001，10(3)：59-60.

StudiesonSDS-PAGEFingerprintsChromatogramofCaprahireusfromDifferentAreasandItsAdulterants

KANG Xinyuan1，LIURui2，LIChunnan1，SUNJiaming1，ZHANGHui1*

(1.ChangchunUniversityofChineseMedicine，Changchun130117，China；2.NanjingUniversityofChineseMedicine，Nanjing210046，China)

Objective：To establish the SDS-PAGE fingerprints and an identification method forCaprahireusL.collected from different areas and its adulterant.Methods：The SDS-PAGE method was adopted to compare the difference ofC.hireusand its adulterants.Results：It showed a similar electrophoretic patterns forC.Hireusof different origins.Five common peaks were determined as characteristic bands.Conclusion：The established method is simple and sensitive.It can provide the basis for identification of habitats and adulterants.

CaprahireusL.；SDS-PAGE；fingerprints

2014-08-15)

角类动物药的标准制定项目——国家药品标准提高暨2015版药典科研任务(2012)

*

张辉，博士生导师，教授，研究方向：天然药物化学；Tel：(0431)86172080，E-mail：zhanghui_8080@163.com

10.13313/j.issn.1673-4890.2015.1.005