维药异常黑胆质成熟剂对TGF-β1诱导增生性瘢痕成纤维细胞的影响

朱瑞祥，李加辅，许言文，钱　璇，马少林

（新疆医科大学第一附属医院烧伤整形科新疆乌鲁木齐830054）

·基础研究·

维药异常黑胆质成熟剂对TGF-β1诱导增生性瘢痕成纤维细胞的影响

朱瑞祥，李加辅，许言文，钱璇，马少林

（新疆医科大学第一附属医院烧伤整形科新疆乌鲁木齐830054）

目的：研究维药异常黑胆质成熟剂（abnormal savda munziq，ASMq）对TGF-β1诱导增生性瘢痕成纤维细胞的影响。方法：组织块法体外培养人增生性瘢痕成纤维细胞，将其分为6组：对照组：加入等体积的培养液；实验组：加或不加不同浓度ASMq（0.2mg/ml，0.4mg/ml，0.6mg/ml，1.0mg/ml）及浓度为5ng/ml的TGF-β1；CCK-8法检测成纤维细胞增殖情况，应用western blot，RT-PCR检测CollagenⅠ及Smad7表达情况。结果：ASMq降低了TGF-β1诱导的成纤维细胞增殖（P＜0.05）；ASMq下调了TGF-β1诱导的成纤维细胞CollagenⅠmRNA及CollagenⅠ的表达（P＜0.05），同时，ASMq明显增加了被TGF-β1抑制的Smad7mRNA和Smad7的表达（P＜0.05）。结论：研究结果表明ASMq通过促进Smad7合成来阻断增生性瘢痕成纤维细胞TGF-β/Smad通路信号转导，从而降低成纤维细胞增殖及CollagenⅠ合成。

异常黑胆质成熟剂；增生性瘢痕；成纤维细胞；TGF-β

增生性瘢痕（Hypertrophic Scar，HS）是以胶原过度沉积为特征的一种病理现象，其诱发的具体机制是多样的，组织学上以成纤维细胞的过度增生和细胞外基质的过度聚集为特征，常发生在外伤、外科手术或烧伤后，且临床治疗比较复杂和困难［1-3］，因此，HS的治疗一直是研究的热点。

笔者前期研究通过兔耳增生性瘢痕动物模型，采用灌胃、外用以及联合应用ASMq，结果表明ASMq可以直接抑制成纤维细胞的生长增殖，降低兔耳增生性瘢痕组织块的发生率［4］。并且ASMq对于体外培养增生性瘢痕成纤维细胞的增殖具有抑制做用（抑制于G0/G1期），这一作用随浓度的变化而变化，同时发现它能促进成纤维细胞的凋亡［5］。本研究通过采用不同浓度的ASMq与TGF-β1对人增生性瘢痕成纤维细胞的干预处理，检测其对增生性瘢痕成纤维细胞增殖，CollagenⅠ及Smad7基因及蛋白表达的影响，为探索维药抑制增生性瘢痕的作用机制及采用维医维药防治增生性瘢痕提供实验和理论依据。

1　材料和方法

1.1试剂及材料

异常黑胆质成熟剂（国药准字：Z65020166）：新疆维吾尔药业有限责任公司；DMEM培养基、胎牛血清（FBS）、胰酶、PBS缓冲液、青霉素和链霉素：美国Hyclone公司；人转化生长因子β1（TGF-β1）：美国Pepro Tech公司；羊抗人CollagenⅠ及Smad7抗体：美国Santa Cruz公司；CCK-8试剂盒、BCA蛋白定量试剂盒、羊抗人GAPDH抗体：武汉博士德公司；反转录试剂盒：美国Thermo公司；BCA蛋白分析试剂盒：美国Pierce公司；引物设计：上海生工公司；Western-Blot系统、PCR扩增仪等：美国Bio-Rad公司，倒置显微镜：德国LEICA公司。

1.2实验方法

1.2.1ASMq的溶解配制：用DMEM培养基溶解（DMSO辅助溶解并且其在终浓度中的含量不大于0.1%））异常黑胆质成熟剂，用含10%FBS的DMEM稀释为0.2mg/ml、0.4mg/ml，0.6mg/ml、1.0mg/ml。

1.2.2标本来源及鉴定：实验所用增生性瘢痕组织均来源于新疆医科大学第一附属医院烧伤整形外科，共8例，男5例、女3例，均为汉族，年龄20～39岁，平均28.75岁，均为烧伤愈合后创面瘢痕持续增生3～12个月，经病理检查确诊为增生性瘢痕，所有患者均无严重系统性疾病及未经过抗瘢痕药物治疗。本实验经新疆医科大学第一附属医院伦理委员会审议通过，所有提供标本患者均签署知情同意书。

1.2.3成纤维细胞培养及处理：将术中切取的增生性瘢痕组织于无菌超净台内以PBS液漂洗3遍，去除残留的血液及其他混杂异物，仔细切除表皮及与之相连的部分瘢痕组织，以防止表皮细胞混杂。将增生性瘢痕组织修剪成1mm×1mm×1mm的组织块，均匀接种于培养皿内，缓慢加入含体积分数10% FBS及青霉素（100U/ml）和链霉素（100μg/ml）的DMEM培养液，于37℃，体积分数5%CO2饱和湿度条件下的培养箱中培养，每周换液2次。待组织块周围细胞长成致密单层后，胰酶消化并传代培养，选择3～6代的细胞用于实验研究。在笔者以下的实验中成纤维细胞在加药干预前均经过无血清DMEM 24小时均一化处理。以下实验中所涉及的成纤维细胞均经过加或不加不同浓度ASMq（0.2mg/ml，0.4mg/ml，0.6mg/ml，1.0mg/ml）及浓度为5ng/ml的TGF-β1处理。

1.2.4细胞增殖实验：应用CCK-8试剂盒检测成纤维细胞增殖情况。增生性瘢痕来源成纤维细胞经传代后取对数期细胞以1×104个/孔细胞数接种于96孔板中，并加入200μl含10%FBS的DMEM培养过夜，而后经过预设方法处理，每组4个复孔，连续检测24h、48h、72h各组细胞增殖情况，在检测前4h每孔各加入20μl的CCK-8工作液，于37℃，体积分数5%CO2培养箱中孵育4h后用酶标仪读取各孔在450nm处的吸光值（OD值），求平均值。

1.2.5RT-PCR检测mRNA表达：将成纤维细胞以4× 105个接种在10cm培养皿中，经预设方法干预24h后应用Trizol液裂解细胞，后经氯仿、异丙醇进一步提取细胞的总mRNA，调整RNA的上样量为1mg/L，以β-actin为内参，进行RT-PCR。相关引物设计如下（表1）：CollagenⅠ上游序列：5′-GTGAACCTGGCAAACAAGGT-3′，下游序列：5′-CTTGGTCGGTGGGTGACTCTG-3；Smad7上游序列：5′-TACCCGATGGATTTTCTCAA-3′，下游序列：5′-TCTTCTCCTCCCAGTATGCC-3′；β-actin上游序列：5′-CACCAACTGGGACGACA-3′，下游序列：5′-GTACTTGCGCTCAGGAGG-3′，用反转录试剂盒进行cDNA的合成（按照说明书步骤进行）：合成后的cDNA进行扩增，方法如下：95℃3min，接着32个扩增循环：95℃30s、52℃30s、70℃30s，72℃3min；取PCR扩增产物6μL在2%的琼脂糖凝胶中进行电泳，而后对凝胶进行图像采集、分析，应用Photoshop CS6读取灰度值，与β-actin相比，数值为各组mRNA相对表达量。

表1　相关引物的设计

1.2.6Western blot检测胶原及Smad7表达：将成纤维细胞以2×105个接种在10cm培养皿中，经前述方法干预48h后收集细胞，应用RIPA裂解液于冰上提取细胞总蛋白，离心并收集上清，用BCA法蛋白定量后调整蛋白上样量并进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，其后应用硝酸纤维素膜进行湿法转膜，而后用5%脱脂奶粉封闭1 h，一抗（CollagenⅠ1:300稀释，Smad7 1:200稀释，GAPDH 1:400稀释）4℃孵育过夜后，应用辣根过氧化物酶标记的二抗孵育2h。然后应用BCA蛋白分析试剂盒进行二抗显影，以上每步之间均用TBST液洗5min/3次，利用Quantity One Version4.6.2图像工作站进行图像采集，应用Photoshop CS6读取灰度值，与GAPDH相比后为各组蛋白表达相对值。

1.3统计学处理

采用SPSS 19.0统计软件包进行统计学处理，实验数据以x±s表示，各组间数据比较采用t检验及单因素方法分析，P＜0.05为有统计学意义。

2　结果

2.1ASMq对增生性瘢痕成纤维细胞形态的影响

成纤维细胞的形态呈长梭形有较大的细胞体，胞质较丰富及呈现两个或三个不同突触长度的多角度形状（图1A）。与对照组（图1A）相比，在TGF-β1+ASMq（0.6mg/ml）组（图1C）和TGF-β1+ASMq（1.0mg/ml）组（图1D）细胞数量减少，形态逐渐变圆和突触逐渐变短或消失；TGF-β1组（图1B）与图1A相比成纤维细胞数量增多，且有较长的纺锤形结构和最大的胞体。

图1　ASMq对成纤维细胞形态的影响（DAB×100）

2.2ASMq抑制TGF-β1诱导的成纤维细胞增殖

通过CCK-8法检测经过ASMq（0.2mg/ml，0.4 mg/ml，0.6mg/ml，1.0mg/ml）与TGF-β1（5ng/ml）处理后24h、48h、72h的成纤维细胞增殖情况（表2）。与对照组相比，TGF-β1显著刺激成纤维细胞增殖（P＜0.05）；与TGF-β1组相比，不同浓度的ASMq对于TGF-β1诱导的成纤维细胞增殖具有抑制作用，这一作用呈时间浓度依赖性（P＜0.05）；与对照组相比，ASMq浓度为0.6mg/ml及1.0mg/ml时显著抑制成纤维细胞增殖（P＜0.05）。

2.3ASMq对成纤维细胞相关mRNA水平的影响

RT-PCR检测ASMq对成纤维细胞CollagenⅠ及Smad7基因表达的影响。如图2，TGF-β1能够显著刺激增生性瘢痕成纤维细胞CollagenⅠmRNA和抑制Smad7mRNA的表达（P＜0.05）。ASMq能够降低TGF-β1诱导的CollagenⅠmRNA表达及促进Smad7mRNA表达，且当ASMq浓度为0.6mg/ml和1.0mg/ml时明显（P＜0.05）。

2.4ASMq对成纤维细胞蛋白表达的影响

Westernblot检测ASMq对成纤维细胞CollagenⅠSmad7蛋白表达的影响。如图3，TGF-β1能够显著刺激增生性瘢痕成纤维细胞CollagenⅠ表达和抑制Smad7蛋白表达（P＜0.05）。ASMq能够降低TGF-β1诱导的CollagenⅠ表达及促进Smad7表达，且当ASMq浓度为0.6mg/ml和1.0mg/ml时明显（P＜0.05）。

表2　ASMq对TGF-β诱导的成纤维细胞增殖的影响

图2　ASMq对成纤维细胞胶原和Smad7 mRNA表达的影响

图3　ASMq对成纤维细胞蛋白表达的影响

3　讨论

HS是皮肤纤维化过度的结果，这一过程有多种细胞因子参与其中，TGF-β1是目前已知与HS形成关系最密切的一种细胞因子，它的存在能显著增加成纤维细胞的增殖及胶原的合成［6-8］。治疗方法主要有：手术切除、放疗、激光及药物，中药治疗一直是研究的重点。维吾尔族医药作为祖国医药重要的组成部分，而ASMq是维吾尔医预防和治疗各种疾病，如肿瘤、肝病、糖尿病、高血压以及心血管疾病的有效处方，其疗效显著，它由菊苣子、芹菜根、菊苣根、香青兰子、黑种草子等十余味维药调制而成。维医实践表明，ASMq可以减轻肝纤维化、肺纤维化疾病，而现代医学认为增生性瘢痕为皮肤纤维化疾病，是全身纤维化疾病的一种，但其对瘢痕的作用机制一直以来都不清楚［9-11］。

TGF-β可分为TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3三种亚型，并通过与受体结合而发挥作用.其中TGF-β1在增生性瘢痕形成过程中尤为重要，其参与了创伤愈合的所有过程，产生细胞的趋化性迁移、增生分化、细胞外基质合成及分泌等重要的生物学效应［12-14］。TGF-β1可直接作用于成纤维细胞，体外低浓度的TGF-β1即可刺激成纤维细胞合成大量CollagenⅠ和细胞外基质。上述TGF-β1的作用可以通过激活由Smad介导的信号传导途径完成。然而TGF-β1分泌后必须经过激活才能发挥效应，即必须与其相应的受体蛋白TGF-βR相结合才能发挥其作用，而目前已知的TGF-βR主要Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型三种［15-16］。

Smads蛋白超家族是TGF-β信号传导通路的下游蛋白。它包括3类：①受体调节型Smads（receptor-associatedSmads，R-Smad），包括Smad1、Smad2、Smad3、Smad5、Smad8；②共同通道型Smads（common-mediator Smads，Co-Smad），包括Smad4；③抑制型Smads（inhibitorySmads，ISmad），包括Smad6和Smad7。Smads是一种中介分子，它能够把TGF-β与其各型受体结合后产生的信号从胞质传到细胞核内［15］。TGF-β信号分子通过跨膜的、具有丝氨酸-苏氨酸激酶活性的受体复合物进行信号转导。TGF-β与其受体TβRII结合后能够激活TβRI受体，激活的TβRI受体使Smad2、Smad3蛋白磷酸化，磷酸化的Smad2、Smad3蛋白方能与Smad4形成具有生物活性的转录复合物进入细胞核内，调节相应靶基因的转录，I-Smads可与R-Smad竞争性结合受体，阻止R-Smad活化或抑制Smads多聚体形成而阻断TGF-β的信号转导［16-17］。

在笔者的研究中观察到，TGF-β1组与对照相比成纤维细胞的增殖明显活跃，这一结果与众所周知的TGF-β1是成纤维细胞细胞功能和增殖的主要调节因子相符。而ASMq组与TGF-β1相比较发现前者细胞增殖又被显著抑制，这说明ASMq对于TGF-β1诱导成纤维细胞增殖有抑制作用。而在RT-PCR及western blot实验中笔者看到：TGF-β1能促进CollagenⅠ合成，抑制Smad7的表达；而ASMq降低了TGF-β1对Smad7合成的抑制作用，而在ASMq干预下CollagenⅠ合成表达是显著降低；由此，笔者推测ASMq通过促进增生性瘢痕成纤维细胞中Smad7表达来抑制细胞增殖及CollagenⅠ合成，即通过促进Smad7合成来抑制TGF-β/Smad通路信号转导，降低了成纤维细胞增殖及CollagenⅠ合成，从而抑制增生性瘢痕的发生发展，本研究有助于明确ASMq对瘢痕作用机制，为笔者以后的实验打下基础，为维药开展临床预防及治疗瘢痕提供充分的理论依据。

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编辑/张惠娟

Effect of uighur medicine abnormal savda munziq on the TGF-β1induced in hypertrophic scar fibroblasts

ZHU Rui-xiang，LI Jia-fu，XU Yan-wen，QIAN-Xuan，MA Shao-lin
（Department of Burns and Plastic Surgery，The First Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University，Urumqi 830054，Xinjiang，China）

Objective To investigate the effect of uighur medicine abnormal savda munziq on the TGF-β1induced in hypertrophic scar fibroblasts.Methods Using tissue explant cultures of human hypertrophic scar fibroblasts，divided into six group:control group:add an equal volume of culture medium；and experimental group:treated with TGF-β1with or without different concentration of ASMq（0.2 mg/ml，0.4 mg/ml，0.6 mg/ml，1.0mg/ml）.CCK-8 assay was adopted to detect the proliferation of fibroblasts.western blot and RT-PCR were performed to detect the expression of CollagenⅠand Smad7.ResultsASMq reduced the TGF-β1induced in fibroblasts proliferation（P＜0.05）；ASMq down-regulation the fibroblast expression of CollagenⅠmRNA and CollagenⅠinduced by TGF-β1（P＜0.05），In addition，ASMq significantly increased the expression of Smad7 mRNA and Smad7 which was suppressed by TGF-β1（P＜0.05）.Conclusions Our results demonstrate that ASMq blocks the TGF-β/Smad signalling pathway in hypertrophic scar fibroblast by up regulation of Smad7，thereby reducing the proliferation of fibroblasts and synthesis of CollagenⅠ.

abnormal savda munziq；Hyperplastic scar；fibroblasts；TGF-β1

R619+.6

A

1008-6455（2015）11-0042-05

国家自然科学基金，维药异常黑胆质成熟剂基于TGF-β/Smad通路防治增生性瘢痕机制研究（项目编号：81260291）

马少林，主任，教授，博士、硕士研究生导师；研究方向：增生性瘢痕防治，组织器官缺损修复再造；通信地址：新疆维吾尔自治区乌鲁木齐市鲤鱼山南路137号，新疆医科大学第一附属医院烧伤整形科，邮编：830054

2015-04-15

2015-06-08