玻璃化超低温对红肉脐橙愈伤组织存活率的影响

许勤勤 童玲 王艳芳

摘要：本研究探讨了玻璃化超低温处理对红肉脐橙愈伤组织存活率的影响。

关键词：红肉脐橙;玻璃化超低温;存活率

中图分类号：  S666;Q813                           文献标识码：  A                       DOI编号：   10.14025/j.cnki.jlny.2015.18.027

红肉脐橙（Citrus sinensis L.cv. red flesh navel orange）原名 Cara Cara，20 世紀 80 年代发现于委内瑞拉，是华盛顿脐橙的天然芽变，到目前为止，它是在甜橙中发现的唯一果肉呈粉红色或红色的脐橙品种[1]。红肉脐橙果实闭脐，果皮橙红，着色均匀，果肉内质，果汁多，酸甜适口，有特殊香味。红肉脐橙丰产性能好，品质优良，耐储存，极具市场潜力。

玻璃化（vitruification）超低温保存植物种质资源始于20世纪80年代，Uagami等首先采用此法尝试保存石刁柏悬浮细胞和体胚[2]，随后Sakai等做了进一步改进。该方法将细胞或组织在冷冻前，用植物玻璃化溶液（plant vitrification solution，PVS）[3]处理，使细胞脱水并使DOMS进入细胞，使细胞在-196℃下，不形成冰晶而成玻璃化状态[4]。

在本研究中，红肉脐橙愈伤组织首先经过PVS处理后，转入到液氮中保存100分钟，用洗脱液洗去PVS后，然后检测细胞存活率。

1 材料与方法

1.1供试材料

1.1.1 柑橘品种 红肉脐橙愈伤组织由华中农业大学作物遗传改良实验室提供，河南大学农业生物技术研究所保存。

1.1.2  所用试剂 PVS（Plant vitrifition solation ）：30%的甘油，15%的乙二醇，15%的DMSO，0.4mol/L蔗糖的液体MS培养基。

洗脱液：1.2mol/L蔗糖的MS溶液，1%TTC（氯化三苯基四氮唑）溶液，0.1mol/L，pH=7的磷酸缓冲液。

1.2方法

1.2.1红肉脐橙愈伤组织的液体悬浮培养 将红肉脐橙愈伤组织转入液体MS培养基中悬浮培养，培养条件：26℃，100 rpm。每周传代1次。

1.2.2超低温处理 把悬浮培养的愈伤组织转入冷冻管中，每管1克愈伤组织。把材料分为4组：未处理组，对照组，A组（PVS处理10分钟），B组（PVS处理15分钟）。将对照组、A组和B组在冰水混合物中处理10～15分钟，然后放入液氮（LN）中，处理100分钟。

1.2.3 细胞活性分析 将冷冻管从液氮中取出，迅速放到40℃水浴锅中温浴2分钟，然后在操作台中吸去PVS溶液，加入洗脱液洗涤40分钟，中间换液3～4次。除去洗脱液，然后用TTC法检测这些愈伤组织细胞活性。

TTC法检测细胞活性：将液氮处理过的细胞转入10毫升离心管中，加入等体积的磷酸缓冲液和TTC溶液各2毫升，置于37℃恒温箱中，黑暗处理1小时，后加入硫酸（1 mol/L）终止反应，吸去TTC溶液和磷酸缓冲液，加入2毫升乙酸乙酯，然后转入研钵中加入少量石英沙，充分研磨，提取被脱氢酶还原后生成的红色的TTF，后把研钵中的乙酸乙酯转入石英比色杯中，再加入3毫升乙酸乙酯，在分光光度计上测量在485nm处吸光度。用这种吸收值（TTC值）表示处理愈伤组织在超低温保存后细胞的生活力。

2 结果与分析

细胞存活率的计算方法：

细胞存活率=（处理后细胞TTC值/未处理细胞TTC值）×100%

表1  TTC法检测结果

注： “未处理”指未用超低温和PVS处理，“对照”指用超低温处理作为对照，“处理A”指PVS处理10分钟后超低温处理，“处理B”指PVS处理15分钟后超低温处理。

由表1可知，不用冷冻保护剂（PVS）处理，存活率为0.80%，用冷冻保护剂（PVS）处理10分钟后，其存活率是1.67%。PVS处理15分钟后，其存活率为4.54%。这说明超低温处理后，细胞受到损伤，其存活率显著降低，冷冻保护剂处理能提高其存活率。

3 讨论

此研究还需要进一步优化PVS脱水温度和脱水时间，降低对细胞的毒性，可以用其他复合冷冻保护剂，也可以优化超低温冷冻程序，采用慢速冷冻法等。

参考文献

[1] 危万虎，李兰，杜九山，魏静，姜明兰.红肉脐橙生育特性与气象条件[J].气象科技.2005，33（01）：77-80.

[2] Uragami A， Sakar A， Nagai M. survival of culture cells and somatic embryo of Asparage officinadis L. cryoprerserved by vitrification[J]. Plant cell Reports， 1989（08）：418-421.

[3] Sakai A ， Kobayshi S， Oiyamal. Cryopresservation of nucellar cells of navel orange（Citrus sinensis ab. var. brasilientis Tanaka）by vitrification [J].Plant Cell Reports， 1990（09）：30-33.

[4] 李广武，郑从飞，唐兵.低温生物学[M].长沙：湖南科学技术出版社，1998：67-72.

作者简介：许勤勤，本科学历，漯河市豫中南林业有害生物天敌繁育研究中心，助理工程师，研究方向：园林绿化及林业有害生物天敌方面的研究。