用于白酒生产的耐酸酵母菌的诱变育种

吴霞

摘 要：以采自白酒厂的酒糟等为原材料，经过分离纯化等一系列过程得到的酵母菌株作为出发菌种。通过紫外线诱变处理，并采用pH=3的选择培养基作为筛选条件，得出紫外照射90～120s为最佳条件，能筛选出适合白酒厂生产工艺条件要求的酒用耐酸酵母菌株。

关键词：白酒生产；酵母菌；诱变育种；耐酸酵母菌

中图分类号：TB

文献标识码：A

文章编号：16723198（2015）19020602

0 引言

酵母菌是酒类生产中一种重要真菌类微生物，在自然环境中，多分存在于含糖量高、偏酸性条件下。25-30℃的温度为其最适合的生长的温度，最适合的pH值是5-6，发酵温度一般为30-34℃。在传统的白酒生產中，在窖池内的发酵时间一般要2-3个月。一般酒精会在酵母菌在发酵的前1-2个月产生，发酵过程中会产生有机酸，伴随着有机酸的不断积累pH逐渐降低，酵母的生长繁殖会受到抑制，发酵作用不断减弱，直至停止，这样原料就不能充分的利用造成原料浪费。可见选择一种耐酸性高的酵母菌有利于促进原料的充分利用，降低生产的成本，提高白酒的产量，带来更大的经济效益。

近年来，随着科技发展，许多新的诱变剂被研发应用于诱变育种，但紫外线作为诱变因子进行诱变育种已经有一段历史了，诱变育种仍有很大的成功率，具有方便、经济等特点。

紫外灯所发射的紫外线波长大约有80%为2537埃，在诱变育种的有效波长范围内。紫外线主要是通过改变DHA来引起生物效应的。DNA对紫外线的吸收作用非常强烈，特别是碱基中的嘧啶，它比嘌呤更为敏感，紫外线可以通过很多形式引起DHA的改变，如DNA链的断裂，DNA分子链的断裂，DNA分子内和分子间的交链，核酸和蛋白质的交链，胞嘧啶的水合作用以及胸腺嘧啶二聚体的形成。可见光能够对紫外线损伤DNA遗传活性的作用进行复活。所以进过诱变后的微生物要被可见光或者是长波紫外线的照射，故诱变处理后的样品要用黑纸包裹，且样品不能存放太久，以免突变在黑暗中经其它机制得到修复。

1 实验部分

1.1 仪器和设备

DG-1多功能恒温箱（上海医疗器械厂）；PHS-3C酸度计（上海虹益仪器厂）；GB4027手提式压力蒸汽灭菌锅（上海柳港医用器械厂）；XS-18双目显微镜（江南医疗器械厂）；H2Q-R振荡器（哈尔滨东联电子公司）；HH-SY21-NI4电热恒温水浴锅（北京长源实验设备厂）；特种净化工作台（苏州净化设备厂）。

1.2 材料和试剂

95%乙醇（重庆化学试剂总厂）；麦芽粉（四川射洪制药厂）；琼脂粉（上海化学试剂总厂）；碘（上海化学试剂三厂）；盐酸（重庆化学试剂总厂）；酒糟、大曲、窖泥、黄浆水（四川邛崃古川酒厂）。

1.3 培养基制备

麦芽粉按20%（m/v）比例加温水配制，55-60℃的恒温水浴锅中糖化5h，过滤后，加入2%（m/v）的琼脂粉搅匀后灭菌30min。在0.1MPa，120℃灭菌30min，冷却后自然pH入冰箱保存。

1.4 实验思路

利用从古川酒厂窖池里采集的相关材料，依据相关的生物化学和微生物学原理、理化技术方法，通过分离纯化得到可作为出发种的酵母菌，再经过紫外线进行诱变育种，就可以选育那些能够在低pH值下依然能够进行生长发育并且发酵能力的比较好的耐酸酵母菌作为酒用酵母菌了。

1.4.1 菌种分离纯化

（1）固体培养基培养。

分别取酒糟、大曲、窖泥，黄浆水1.5g，加入无菌生理盐水制成菌悬液，移取酒糟、大曲、窖泥，黄浆水制成的菌悬液各1mL，用无菌生理盐水按10倍稀释6次，分别移取稀释液1mL到各平板中，迅速用涂布器涂抹均匀后，培养皿封盖，待稀释的培养液渗入麦芽汁琼脂固体培养基后，倒置在恒温箱中以28℃下培养2天。按此方法转接培养4次，直至得到纯种菌株后，斜面菌种保藏。每个样品制备6个平行平板。

（2）镜检确定出发菌种。

结合镜检，选择颜色为乳白色，表面光滑有光泽，长势丰满且无杂菌斑的单菌落，经镜检进一步确定是酵母菌，将其作为下一步诱变育种的出发菌种。

1.4.2 诱变育种

诱变选育的过程：

诱变选种的过程是比较繁杂的过程，首先要选出发种然后制备菌悬液，利用紫外线照射处理，作稳定性能培养，进行稀释涂菌分离、镜检挑菌、初筛、斜面传代，再经过复筛，最后才能得到目的菌株。

（1）制备菌悬液。

选取鉴定纯种的出发菌种，通过生理盐水洗涤斜面，按无菌操作法制备菌悬液，盛入三角瓶中。三角瓶置于振荡器180r/min，以使菌体全部以单细胞状态分散开来。再将菌液用以灭菌的漏斗滤纸过滤，得到较清澈的菌悬液。以血球计数板的方法来计算菌悬液的菌体浓度，用生理盐水稀释成浓度约为1×106个/mL。

（2）紫外诱变。

无菌操作台上，用无菌移液管分别移取8份5mL的菌液至8个7cm口径无菌平皿中，编号为1-8号，平皿置于紫外灯30cm处。关闭其余照明，使实验条件为暗室，同时打开红灯。

其中1号平皿作为对照，即照射时间为0s；2号平皿置于磁力搅拌器，使菌体一直保持悬浮。打开紫外灯2min后波长趋于稳定后，移开平皿的盖子开始计时。第30s时盖上平皿的盖子，并关掉紫外灯和搅拌器，将2号平皿用黑色纸覆盖。按同样的操作，将3号按60s、4号按90s、5号按120s、6号按150s、7号按180s、8号按240s的照射时间进行处理。

（3）诱变菌株的稳定性能培养。

用移液管分别移取1-8号菌液各1mL，分别用生理盐水按10倍稀释4次，按无菌操作接入麦芽汁固体培养基上，用黑色牛皮纸包好培养皿，28℃培养2天。每个样品做3组平行。

根据3组1-8号平板长出的单菌落平均数，可以算出1-8号的菌液的浓度。1号值作为原始菌液的活菌数，2-8号值分别代表不同时间照射后菌液的活菌数，这样即可算出照射后菌液的菌体的存活和死亡的比例。

根据各照射剂量的死亡率，如果照射剂量太小，变异菌体的占有率非常低，反之，菌体的存活比例也会比较低，都不宜于菌体的挑选。我们一般要求照射死亡在80%-90%之间。因此最后确定4号和5号菌液为最佳。

（4）酸式麦芽汁琼脂固体培养基的制备。

用稀盐酸调加热溶解后的麦芽汁琼脂培养基为pH=3。用酸式麦芽汁琼脂固体培养基倒平板，共制备10个。

（5）耐酸菌株筛选。

将（3）中得到的作稳定性状培养的4号5号诱变后的菌液的培养液，用生理盐水按10倍稀释6次后用移液管各取1mL，将其接种到pH=3的酸式麦芽汁琼脂固体培养基上，倒置28℃下培養2天。每个样品做3组平行。重复转接4次，得到目的筛选菌株。

2 结果与讨论

在实际的生产过程中，随着发酵时间，酵母菌所处的生长环境的会慢慢变低，最后会达到一个很低的水平，比如黄浆水，最后的pH值就降低到了3。酵母菌低是很难在这种pH值的环境下生存的。由此可见在发酵过程中会有大量的有机酸不断地积累，到整个过程的后期由于有机酸的积累酸度处于一个较高的程度这就抑制了发酵。酵母菌随pH值的降低，其单菌落的直径值和厚度值不断变小，酵母菌的生长繁殖就会受到抑制，可见pH值的变化严重的影响着酵母菌的生长繁殖。故筛选一种耐酸酵母菌，在生产上具有重要意义。

采用紫外线诱变方式可改变普通酵母菌株的相关性能，实验表明4号和5号菌液的紫外线照射剂量（即90s和120s）为最佳。诱变时间开始逐渐增加对生长有利，当超过120s后，其生长又受到抑制，故紫外诱变最佳条件为90～120s。

3 结论

通过紫外线诱变方法，有效地筛选到了所需要的耐酸性能较好的酵母菌种，诱变条件为紫外灯照射90～120s，这对白酒的生产具有一定的指导意义。

参考文献

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