红景天苷对大鼠心肌缺血预处理后血管内皮生长因子表达的影响

2015-09-17王文杰陈红英彭吉霞李贤玉吴胜英

中国医药导报 2015年9期

王文杰陈红英彭吉霞李贤玉吴胜英

1.湖北医药学院附属十堰市太和医院骨2科，湖北十堰 442000；2.湖北医药学院机能实验室，湖北十堰 442000；3.湖北医药学院病理生理学教研室，湖北十堰 442000

临床常采用冠脉搭桥术、冠脉溶栓术、心肌梗死再通术等方法治疗心肌梗死等疾病，但此类治疗方法常引起急性心肌缺血再灌注损伤并严重威胁人类生命安全[1]，为减轻及避免缺血再灌注损伤造成的严重后果，寻找安全可靠的治疗心肌缺血再灌注损伤及缺血预处理药物显得极为重要。近年来研究发现血管内皮生长因子（VEGF）具有增加微、小静脉血管的通透性、促使血管内皮细胞分裂增殖及诱导血管再生等作用[2]。现代医学实验亦证实红景天注射液的主要成分红景天苷能增加受损血管内皮细胞分泌VEGF，并有效地抗缺氧，抑制过氧化脂质的产生[3]，抑制冠状动脉血栓形成，增加冠状动脉供血流，解除心肌梗死时冠状动脉痉挛，对预防和治疗心肌梗死有明确的临床疗效，对心肌缺血再灌注损伤具有保护作用[4]，故临床常用于此类疾病的辅助治疗及预防。由于其对心肌缺血预处理后心肌血管内皮再生的影响及其机制鲜有系统的实验报道，本实验采用红景天苷对大鼠心肌缺血再灌注损伤模型进行7 d的缺血预处理，系统观察了其对心肌冠状动脉血管内皮细胞VEGF的分泌及心肌超氧化物歧化酶（SOD）等酶学的影响，探讨其作用机制，为其临床治疗及预防心肌缺血再灌注损伤提供实验及理论依据。

1 材料与方法

１.1 实验动

SPF级健康Wistar大鼠24只，鼠龄45～60 d，体重（200±50）g，采用随机数字表编号分为空白对照组、缺血/再灌注组、红景天苷预处理组，每组8只。实验动物由湖北医药学院实验动物中心提供，实验动物设施使用许可证SYXK（鄂）2011-0031，实验动物生产许可证SCXK （鄂）2011-0008。动物房温度18～25℃，湿度50%～75%，12 h交替光照，分笼饲养，自由饮水，普通饲料喂养，每日观察动物进食情况，称体重，及时清理粪便，本研究中动物处置方法符合动物伦理学标准。

1.2 仪器及药品

丙二醛（MDA）、过氧化氢酶（CAT）、SOD 测试盒（厂家:上海江莱生物科技有限公司，批号:KB13297），大鼠VEGF共调节趋化因子1（VCC1）酶联免疫吸附测定（ELISA）试剂盒（上海酶联生物科技有限公司生产，产品货号:mi028457）。提取mRNA试剂及反转录试剂（美国Invitrogen公司）。红景天苷粉（杭州正大青春宝药业有限公司，10 mg/瓶，国药准字 GR0532），使用前用蒸馏水配制成1%溶液并保存于4℃冰箱备用。

1.3 缺血预处理方法

红景天苷预处理组大鼠在制备心肌缺血动物模型前 7 d，经尾静脉注射红景天苷 2 mL/（kg·d），按此剂量连续预处理7 d，空白对照组及缺血/再灌注组注射等量生理盐水。

1.4 心肌缺血动物模型制备

在经缺血预处理7 d后，参照文献[5]，所有动物在造模前夜停止喂食，不禁水，腹腔注射2%戊巴比妥钠（120 mg/kg）麻醉，仰卧位固定于手术台，接Ⅱ导联，采用BL-420F生物信号采集系统同步记录大鼠Ⅱ导联心电图。缺血/再灌注组及红景天苷预处理组经尾静脉注射垂体后叶素（1.5 U/kg），5 s内注射完毕，观察并记录Ⅱ导联心电图。当出现明显的ST段上移、T波高耸、窦性心动过缓、期前收缩等心律失常性心电图即模型复制成功，空白对照组注射等量生理盐水作为对照。

1.5 检测指标

参照文献[6]，分别于缺血预处理前后经大鼠眼眶静脉采血，采用ELISA法测定SOD、CAT活性。参照文献[7]，在缺血预处理前及缺血预处理7 d后，三组动物取血完毕后用手术剪断头处死动物，剪下心脏，取左心室部位心肌组织，暂存至30℃低温冰箱保存待测，以备VEGF蛋白分析。检测时取心肌组织标本研磨，以3000 r/min高速离心（离心半径70 mm）取上清液，严格按SP试剂盒说明操作，采用双抗体夹心ELISA法测定心肌组织FLK-1及FLK-1 mRNA、HIF-1α及HIF-1α mRNA、VEGF蛋白质及VEGF mRNA的表达；采用ELISA严格按试剂盒说明检测心肌MDA含量。

1.6 统计学方法

统计分析软件使用SPSS 15.0，计量资料采用均数±标准差（±s）表示，采用多因素方差分析，两两比较采用LSD-t检验，计数资料采用χ2检验，相应的多因素分析分别采用双向方差CMH-χ2检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 红景天苷对大鼠HIF-1、HIF-1α mRNA表达的影响

空白对照组缺血预处理前及缺血预处理7 d后HIF-1、HIF-1α mRNA阳性表达差异无统计学意义（P＞0.05）；缺血/再灌注组在缺血预处理7 d后测量值显示HIF-1、HIF-1α mRNA表达呈升高趋势，与空白对照组及本组预处理前比较，差异有统计学意义（P ＜ 0.05），提示大鼠 HIF-1、HIF-1α mRNA 表达的增高与急性心肌缺血密切相关；红景天苷预处理组在预处理7 d后测出HIF-1α、HIF-1α mRNA比缺血/再灌注组增加更为明显，与空白对照组、缺血/再灌注组及本组预处理前比较，差异有统计学意义（P＜0.05），提示红景天苷具有显著提高HIF-1α、HIF-1α mRNA的作用。见表1。

表1 红景天苷对大鼠心肌缺血预处理HIF-1、HIF-1α mRNA阳性表达的影响（n=8，±s）

注:与空白对照组比较，*P＜0.05；与缺血/再灌注组比较，△P＜0.05；与本组预处理前比较，▲P＜0.05；HIF-1α:缺氧诱导因子-1α

组别 HIF-1α（PU）预处理前预处理7 d HIF-1α mRNA预处理前预处理7 d空白对照组缺血/再灌注组红景天苷预处理组5.26±0.125.29±0.105.32±0.145.34±0.126.79±0.19*▲8.71±0.23*△▲0.49±0.070.47±0.060.50±0.070.44±0.080.45±0.05*▲0.83±0.12*△▲

2.2 红景天苷对大鼠心肌VEGF、VEGF mRNA表达的影响

空白对照组缺血预处理前及缺血预处理7 d后，大鼠心肌VEGF、VEGF mRNA表达差异无统计学意义（P＞0.05）；缺血/再灌注组在心肌缺血缺氧性损伤时（缺血预处理 7 d）测出 VEGF、VEGF mRNA表达明显增强，与空白对照组及本组预处理前比较，差异有统计学意义（P＜0.05），提示缺血、缺氧是促进VEGF分泌的最主要因素，此时大鼠心肌损伤严重。而红景天苷预处理组在缺血预处理7 d后VEGF、VEGF mRNA表达明显增强，与空白对照组、缺血/再灌注组及本组预处理前比较，差异有统计学意义（P＜0.05），揭示采用红景天苷对大鼠大鼠急性心肌缺血预处理可提高VEGF、VEGF mRNA分泌的作用。见表2。

表2 红景天苷对大鼠急性心肌缺血预处理VEGF、VEGF mRNA表达的影响（n=8，±s）

注:与空白对照组比较，*P＜0.05；与缺血/再灌注组比较，△P＜0.05；与本组预处理前比较，▲P＜0.05；VEGF:血管内皮生长因子

组别 VEGF（pg/mL）预处理前预处理7 d ?VEGF mRNA预处理前预处理7 d空白对照组缺血/再灌注组红景天苷预处理组56.34±4.3157.42±4.2656.54±5.3757.61±4.1285.90±7.30*▲114.37±9.15*△▲0.55±0.100.57±0.070.54±0.090.57±0.100.74±0.16*▲1.14±0.19*△▲

2.3 红景天苷对大鼠FLK-1、FLK-1 mRNA表达的影响

缺血预处理7 d后，红景天苷预处理组FLK-1、FLK-1 mRNA阳性表达均明显增强，与空白对照组、缺血/再灌注组及本组预处理前比较，差异有统计学意义（P ＜ 0.05）。见表 3。

表3 红景天苷对大鼠心肌缺血预处理FLK-1、FLK-1 mRNA表达的影响（n=8，±s）

注:与空白对照组比较，*P＜0.05；与缺血/再灌注组比较，△P＜0.05；与本组预处理前比较，▲P＜0.05；FLK-1:受体胎肝激酶1

组别 FLK-1（PU）预处理前预处理7 d ?FLK-1 mRNA预处理前预处理7 d空白对照组缺血/再灌注组红景天苷预处理组4.62±0.544.59±0.494.70±0.514.66±0.146.61±0.19*▲7.47±0.61*△▲6.77±0.266.68±0.236.65±0.306.79±0.317.89±0.27*▲9.58±0.35*△▲

2.4 红景天苷对大鼠MDA、SOD、CAT水平的影响

空白对照组MDA、SOD、CAT在缺血预处理前及缺血预处理7 d前后差异无统计学意义（P＞0.05）；缺血/再灌注组血清SOD、CAT水平明显降低，心肌MDA增高，与空白对照组及缺血预处理前比较，差异有统计学意义（P＜0.05），说明缺血/再灌注组心肌损伤严重造模成功。在缺血预处理7 d后测量值显示，红景天苷预处理组SOD、CAT含量明显增高，MDA降低，与空白对照组、缺血/再灌注组及本组预处理前比较，差异有统计学意义（P＜0.05），提示红景天苷具有促进SOD和CAT的释放、增强组织对自由基清除活性酶、抑制脂质过氧化反应的作用。见表4。

3 讨论

大量中草药近年来被应用到临床预防及治疗心肌梗阻等可能造成缺血再灌注损伤的一类疾病中，其中红景天在临床上大量应用并被证实有可靠疗效。红景天为景天科植物红景天或大花红景天，性寒，味甘涩，归脾、肺经，药用其根茎，素有“高原人参”之称[8-9]，主产于高原高寒的青海、西藏、西宁、四川及东北三省等地区。天然植物红景天的根茎含红景天苷元、红景天苷、没食子酸、二苯甲基六氢吡啶、β-谷甾醇等多种有效成分[10]。红景天苷是大株红景天注射液的主要有效成分，其冻干粉呈淡黄色[11]，具有抗疲劳、抗缺氧、抗寒冷、抗微波辐射、增强心脑组织耐缺氧、提高免疫力、抑制缺血再灌注损伤引起的脂质过氧化、清除自由基等作用[12]。

表4 红景天苷对大鼠 MDA、SOD、CAT水平的影响（n=8，±s）

注:与空白对照组比较，*P＜0.05；与缺血/再灌注组比较，△P＜0.05；与本组预处理前比较，▲P＜0.05；SOD:超氧化物歧化酶；MDA:丙二醛；CAT:过氧化氢酶

组别 SOD（U/mL）预处理前预处理7 d MDA（nmol/mL）预处理前预处理7 d CAT（kU/g）预处理前预处理7 d空白对照组缺血/再灌注组红景天苷预处理组219.57±17.29220.34±15.71218.97±16.45224.01±19.71122.29±13.54*▲174.29±10.17△▲2.53±0.272.50±0.212.54±0.172.49±0.1732.15±3.43*▲19.47±1.18△▲11.55±0.1612.51±0.1412.53±0.1812.59±0.127.96±0.17*▲14.47±0.28△▲

机体氧自由基的生成与清除在正常情况下维持着动态平衡，血管内皮及功能保持正常，当急性心肌缺血梗死时，心、脑和肝脏等组织由于缺血再灌注会产生大量的氧自由基并发生脂质过氧化反应，同时机体SOD、CAT等自由基清除酶活性急剧降低，造成自由基清除酶对氧自由基清除能力下降，MAD大量产生[13]，进而导致心、脑和肝脏等血管内皮细胞严重受损。故MAD、SOD、CAT等在心肌细胞损伤或坏死时的含量变化可间接反映细胞受自由基损伤的程度。而VEGF其结构和功能与原发现的血管通透性因子（VPF）一致，故称为VEGF/VPF[14]。它是一种高度特异性的促血管生长因子，具有促进多种血管活性物质合成、血管内皮细胞增殖迁移及再生、参与冠状动脉侧支循环形成的调节[15]，故VEGF在临床上常作为血管内皮功能的重要指标之一。故本研究以VEGF的分泌及MAD、SOD、CAT等酶学指标来观察分析红景天苷对大鼠急性心肌缺血预处理的影响。

在本实验中，缺血/再灌注组大鼠在造模成功7 d后，其HIF-1α及HIF-1α mRNA、VEGF蛋白质及VEGF mRNA、FLK-1及FLK-1 mRNA的阳性表达均有不同程度增强，说明心肌缺血、缺氧是促进VEGF分泌的最主要因素，血管内皮受损严重。在经尾静脉注射红景天苷缺血预处理7 d后，红景天苷预处理组其HIF-1α及HIF-1αmRNA、VEGF蛋白质及VEGFmRNA、FLK-1及FLK-1 mRNA的阳性表达较缺血/再灌注组进一步明显增强，提示红景天苷具有促进急性心肌缺血预处理大鼠VEGF的分秘的作用，这与温晓竞等[16]研究红景天注射液诱导缺血心肌的血管再生，促进受损血管内皮修复的功能一致。分析认为，可能与红景天苷诱导缺血心肌的血管再生、改善微循环、增加冠脉灌注和心肌供氧、活血化瘀的药性特征有关，另一方面也可能与其促进Ca2+-ATP酶活性恢复，增强钠钾ATP酶活力，减少细胞内钙超载，并通过钠钾ATP酶调节钠氢交换来抑制钠钙交换，阻止Ca2+内流，改善心肌组织能量代谢[17]，进而改善心肌缺血而起到保护作用有关[18]。过氧化氢是机体代谢过程中产生的有害代谢产物，在发生脂质过氧化反应时对机体组织器官造成严重损害，而CAT是细胞催化过氧化氢分解成氧和水的酶，清除体内的过氧化氢，从而使细胞免于遭受过氧化氢的毒害，是生物防御体系的关键酶之一。实验观察到，红景天苷明显降低MAD，增强SOD、CAT酶活性，说明其可增强SOD及CAT等自由基清除活性酶的活性，抑制有害代谢产物过氧化氢造成的脂质过氧化反应，对急性心肌缺血再灌注损伤模型大鼠有保护作用。这与甑志军等[19]报道的红景天苷具有改善心肌组织的能量代谢，改善病灶缺血、水肿，促进细胞功能恢复，减轻缺血再灌注后组织损伤而起到保护心血管系统的作用相同。

缺血预处理（包括药物预处理）在临床防治缺血性疾病尤其缺血再灌注损伤中有重要意义，积极寻找具有促进缺血心肌血管再生，增强SOD、CAT酶活性以减轻心肌缺血再灌注损伤，防止心肌细胞坏死的药物意义重大[20-21]。本实验提示红景天苷具有增加血管内皮VEGF分秘、增强SOD、CAT酶活性的作用，由于红景天苷有类似于VEGF的特异性促血管内皮细胞分裂增殖、增加血管通透性的作用，而促进血管新生，促进缺血区侧枝循环的建立，从而改善心肌血供，因此它在治疗心肌缺血上有广泛的应用前景。但缺血再灌注损伤机制是一个多因素参与的复杂过程，红景天苷如何在缺血预处理各个环中节发挥调节和干预，阻断心肌缺血再灌注损伤的发生，还有待于深入研究后对其作用机制加以阐明。

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