基于抗氧化活性优化金花茶花超声提取工艺

牛广俊，朱 思，王维华，魏艺聪，林 娜，陈清英，梁一池

(1.福建中医药大学药学院，福建 福州 350122； 2.漳平市展宏金花茶专业合作社，福建 漳平 364400)

基于抗氧化活性优化金花茶花超声提取工艺

牛广俊1，朱 思1，王维华1，魏艺聪1，林 娜1，陈清英2，梁一池1

(1.福建中医药大学药学院，福建 福州 350122； 2.漳平市展宏金花茶专业合作社，福建 漳平 364400)

以金花茶的花为研究对象，探讨乙醇体积分数、料液比、提取时间3个因素对金花茶花超声提取物抗氧化能力的影响；在此基础上，以提取物的抗氧化能力为响应值，采用Box-Benhnken中心组合设计和响应面分析法，优化金花茶花超声提取工艺。结果表明，金花茶花最佳提取工艺为：乙醇体积分数51%、料液比1∶48 g·mL-1，提取时间53 min。在此条件下，提取物抗氧化能力是阳性对照药DL-α-生育酚(0.218 mg·mL-1)的1.5倍。金花茶花提取液中三大抗氧化物质总酚、总黄酮、皂苷的得率分别为：6.25%、17.18%、13.26%。

金花茶；抗氧化能力；响应曲面法；超声提取工艺

金花茶(CamelliachrysanthaChi)是山茶科山茶属金花茶组植物，常绿灌木或小乔木，主要分布在广西省和福建省部分地区，具有极高的观赏价值。金花茶的出现填补了山茶科黄色花色的空白，引起国内外植物学界和园艺学界的广泛关注，有“茶族皇后”的美称，已列入国家一级保护植物。金花茶花不仅具有极高的观赏价值，而且金花茶花中含有较多的黄酮、多糖、皂苷、茶多酚等抗氧化活性成分，具有广泛的药用价值和营养价值，因此又被誉为“国宝神茶”[1]。目前，从植物中寻找高效、廉价、低毒的天然抗氧化剂成为抗氧化剂的发展趋势，金花茶花因具有较强的抗氧化作用[2]引起广泛关注。多指标优化提取工艺研究是近年来中药生产研究的一个热点，单一指标的优化不能满足生产管理的需要[3]。关于金花茶花中活性成分的提取工艺的研究，尚未见文献报道。为了更好地利用经济作物资源，本文利用中药整体性观念，以茶、药两用佳品金花茶花为例，以DL-α-生育酚为阳性对照药物，以提取物对DPPH自由基消除能力为抗氧化评价指标，采用响应曲面法[4-5]对金花茶花抗氧化活性物质提取工艺进行优化。利用所优化的提取条件同时提取金花茶花中抗氧化活性成分，计算总黄酮、总皂苷、茶多酚的得率，确定最佳提取工艺，以期为金花茶花综合开发提供参考。

1 材料与方法

1.1 原料、试剂

金花茶的花由漳平市展宏金花茶专业合作社提供，烘干粉碎后过60目，备用。所有试剂均为分析纯：1，1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)，西格玛奥德里奇公司；芦丁、没食子酸、人参皂苷Rg1，成都曼斯特生物科技有限公司；香兰素、三氯化铁·六水、铁氰化钾、十二烷基硫酸钠，国药集团化学试剂有限公司。水为超纯水。

1.2 试验设备

Infinite M200 Pro多功能酶标仪(瑞士帝肯(Tecan)公司)；Costar 96孔酶标板(美国康宁(Corning)公司)；UV-9100紫外-可见分光光度计(北京瑞利分析仪器公司)；THC-10B数控超声波提取器(济宁天华超声电子仪器有限公司)等。

1.3 试验设计

1.3.1 单因素试验 单因素试验考察乙醇不同体积分数(30%、50%、60%、70%、80%、90%)、料液比(1∶10、1∶15、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60 g·mL-1)、提取时间(10、20、30、40、50、60 min)3个因素对金花茶花提取物抗氧化能力的影响。

1.3.2 提取工艺最优参数的确定 在单因素试验的基础上，以金花茶花提取物对DPPH自由基的清除能力为指标，依次改变提取液的乙醇体积分数、料液比、提取时间，进行对比分析，并确定三因素三水平的最佳提取参数进行响应面分析，试验设计的水平及编码见表1。

1.4 金花茶花抗氧化活性物质提取流程

表1 Box-Behnken试验设计的因素及水平

精密称取金花茶花粉末1.0 g，置于100 mL的锥形瓶中，按试验设计确定的工艺条件提取，补齐提取液到60 mL，12000 r·min-1离心10 min，取上清液1.0 mL，定容至10 mL，得金花茶花供试品溶液。

1.5 DPPH自由基消除率的测定

精密移取DPPH工作液(A值在1.2～1.3之间)1.0 mL置于2.0 mL离心管中，精密加入提取液50 μL，充分摇匀，静置反应30 min。反应完成后取100 μL置于96孔酶标板中，于519 nm处测定A值。同时取DPPH工作液1.0 mL于离心管中，加入无水乙醇50 μL，充分混合，30 min后取100 μL置于96孔酶标板中，于519 nm处测定A0值，以DL-α-生育酚0.218 mg·mL-1为阳性对照药，按下式计算清除率。DPPH自由基清除率(%)=(1-A/A0)×100%。

1.6 抗氧化活性成分得率的测定

按照文献[6]报道的方法，分别采用亚硝酸钠-硝酸铝比色法、普鲁士蓝法、高氯酸比色法测定提取液中总黄酮、总酚、总皂苷的含量，按下式计算得率，活性成分提取率(%)= 提取液中所测成分的质量/原料总质量×100%。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果与分析

2.1.1 乙醇体积分数 固定料液比为1∶50 g·mL-1，提取时间为30 min，室温，超声功率为500 W，40 kHz，考察不同体积分数乙醇对抗氧化活性物质的影响，结果见表2。提取物的抗氧化能力随着乙醇体积分数的升高表现出先增加后减小的趋势，抗氧化活性成分易溶于50%乙醇。综合考虑其他影响因素，选取体积分数分别为30%、50%、70%的乙醇进行响应面分析，以确定乙醇最佳提取体积分数。

2.1.2 提取时间 固定料液比为1∶50 g·mL-1，乙醇体积分数为50%，超声功率为500 W、40 kHz，考察不同提取时间对抗氧化活性物质的影响，结果见表3。结果发现提取时间为40 min时，提取物对DPPH自由基的清除能力最强，随着提取时间延长，提取物抗氧化能力有所下降，分析原因是长时间超声会破坏抗氧化活性成分。综合考虑其他影响因素，选取提取时间分别为20、40、60 min进行响应面分析，以确定最佳提取时间。

表2 乙醇提取分数对金花茶花提取物抗氧化能力的影响

表3 提取时间对金花茶花提取物抗氧化能力的影响

2.1.3 料液比 固定乙醇体积分数为50%，提取时间为40 min，室温，超声功率为500 W、40 kHz，考察不同料液比对抗氧化活性物质的影响，结果见表4。发现料液比为1∶50 g·mL-1后增大液料比对DPPH自由基的清除能力无显著的增强，说明抗氧化成分在50倍的溶剂中得到充分溶解。综合考虑其他影响因素，选取液料比分别为1∶40、1∶50、1∶60 g·mL-1进行响应面分析，以确定最佳料液比。

表4 料液比对金花茶花提取物抗氧化能力的影响

2.2 响应面法提取条件的优化

2.2.1 响应面设计及试验结果 在单因素试验的基础上，选择乙醇体积分数、料液比、提取时间为考察因素，采用Design-Expert 8.0软件进行分析与设计试验，测定各个样品对DPPH自由基的清除能力，金花茶花中抗氧化物质提取的Box-Behnken设计试验结果见表5。

应用Design-Expert 8.0 软件对表5中数据进行二次多元回归分析，得A、B、C 3因素与金花茶花中抗氧化物质对DPPH自由基消除率的二元多项回归方程：Y=51.48+0.55A+0.39B+2.32C+1.04AB+0.25AC-1.72BC-6.64A2-1.43B2-2.11C2。对所得回归方程进行显著性检验，结果见表6。

由表6可知，因变量与全体自变量的线性关系显著(r=0.9117)，模型的显著水平远远小于0.05，而方程的失拟项显著性水平大于0.05，说明未知因素对方程干扰小，所建立的方程可靠。各试验因子对响应值的影响不是简单的线性关系，影响提取物抗氧化活性的因素顺序为：提取时间>乙醇体积分数>料液比。由响应面分析(图1～图3)结果发现，提取物的抗氧化能力随3个因素水平的增大均呈先增加后减少的趋势；B与C交互作用最强，A与C交互作用最弱，与表3得出的结论一致。

表5 金花茶花中抗氧化物质的超声提取工艺响应面试验结果

*：以DL-α-生育酚0.218 mg·mL-1为阳性对照药。

2.2.2 预测模型的验证及抗氧化活性成分得率的计算 响应面模型预测的最优提取条件是用50.69%的乙醇，以料液比为1∶47.55 g·mL-1，室温下超声提取52.99 min，预测所得提取物对DPPH自由基消除率为52.19%。由于设备的限制，在现有条件下，对优化条件稍作调整：以料液比为1∶48 g·mL-1，体积分数为51%的乙醇，室温下超声提取53 min。取6份相同样品，按上述条件进行提取，以DL-α-生育酚0.218 mg·mL-1为阳性对照药，测定各个样品对DPPH自由基的清除能力，及总黄酮、总酚、总皂苷的得率，重复测定3次，结果见表7。

表6 超声提取工艺回归模型方差分析

*：**为极显著(P< 0.01)；*为显著(0.01

图1 乙醇体积分数与料液比对提取物消除DPPH自由基能力的影响图2 乙醇体积分数与提取时间对提取物消除DPPH自由基能力的影响

表7 6份金花茶花样品提取物对DPPH消除率及抗氧化物质得率 %

图3 提取时间与料液比对提取物消除DPPH自由基能力的影响

试验测得数据与模型预测数据的相对误差为0.5%，没有显著性差异，说明利用该模型提取金花茶花中抗氧化活性成分稳定、可行。

3 结论

本文采用超声提取金花茶花中抗氧化活性成分，在单因素试验的基础上，将响应曲面法首次应用于优化金花茶花中抗氧化物质的同时提取。考察了乙醇体积分数、料液比、提取时间对所得提取物的抗氧化能力的影响，得到最佳提取条件：料液比为1∶48 g·mL-1，51%的乙醇，室温下超声提取53 min。在此条件下，金花茶花提取物的生药浓度为16.667 mg·mL-1，金花茶花中三大抗氧化物质总酚、总黄酮、皂苷的得率分别为6.25%、17.18%、13.26%，提取物对DPPH自由基消除率为51.92%，以DL-α-生育酚0.218 mg·mL-1为基准，金花茶花提取物消除DPPH自由基的能力是其1.5倍。DDPH自由基并非人体实际产生的自由基，但是 DDPH自由基的猝灭能力仍然可以有效地评价抗氧化剂的活性，因此在所优选的提取工艺下，金花茶花提取物有较强的抗氧化能力。

[1]曹芬，樊兰兰.金花茶研究进展[J].中国药业，2013，22(4)：95-96.

[2]牛广俊，朱思，梁一池，等.金花茶不同部位多糖的测定及体外抗氧化活性研究[J].中国试验方剂学杂志，2014，20(20)：168-172.

[3]彭晓霞，路莎莎.响应面优化法在中药研究中的应用和发展[J].中国实验方剂学杂志，2011，17(19)：296-299.

[4]朱素英.响应曲面法优化三七根多酚的提取工艺[J].食品工业科技，2014，35(14)：278-281.

[5]刘军海，耿敬章.超声辅助提取银杏酸工艺优化试验[J].福建林业科技，2014，41(1)：92-96.

[6]唐前，罗燕英，黄连冬，等.金花茶组植物化学成分的定量分析[J].时珍国医国药，2009，20(4)：769-771.

Optimization of Ultrasound Extraction Process ofCamelliachrysanthaChi based on Antioxidant Activity

NIU Guang-jun1，ZHU Si1，WANG Wei-hua1，WEI Yi-cong1，LIN Na1，CHEN Qing-ying2，LIANG Yi-chi1

(1.FujianUniversityofTraditionalChineseMedicine(TCM)，Fuzhou350122，Fujian，China； 2.CamelliacooperativesofZhanHong，Zhangping364400，Fujian，China)

With the antioxidant activity ofCamelliachrysanthaextracts as indicators，using Box-Benhnken and Response Surface Methodology optimized the ultrasonic extracting procedure，based on the study of the influence of alcohol volume fraction，the ratio of solid to liquid and the extraction duration on the extracts antioxidant ability.Experimental results indicated that the optimum extracting conditions were as following：51% alcohol，treating with ultrasonic for 53 min and the ratio of solid to liquid was 1∶48.Under these conditions，the free radical scavenging rate ofCamelliachrysanthaextracts is 1.5 times of positive control medicine DL-alpha-Tocopherol (0.218 mg·mL-1).Furthermore，the yield of total phenols，flavonoids and saponin were 6.25%，17.18% and 13.26%.

Camelliachrysantha；antioxidant；response surface methodology；ultrasound extraction process

2014-11-08；

2015-01-02

福建省教育厅项目( JA11138)；福建省龙岩市资助项目(201367)

牛广俊(1990—)，男，山东聊城人，福建中医药大学药学院硕士研究生，从事药材质量控制与品质评价的研究。E-mail：ytdxngj@163.com。

梁一池(1952—)，男，福建福鼎人，福建中医药大学药学院教授，博士生导师，从事中药材质量控制与品质评价的研究。E-mail：fafulyc@126.com。

10.13428/j.cnki.fjlk.2015.04.003

S685.14

A

1002-7351(2015)04-0013-05