福建山樱花总RNA提取方法比较分析

荣俊冬，张迎辉，薛艺敏，王珍添，陈凌艳，郑郁善，

(1.福建农林大学林学院，福建 福州 350002； 2.福建农林大学园林学院，福建 福州 350002 )

福建山樱花总RNA提取方法比较分析

荣俊冬1，张迎辉2，薛艺敏2，王珍添2，陈凌艳2，郑郁善1，2

(1.福建农林大学林学院，福建 福州 350002； 2.福建农林大学园林学院，福建 福州 350002 )

以福建山樱花嫩叶为试验材料，采用Trizol法、CTAB法、CTAB-LiCl法、百泰克试剂盒法和天根试剂盒法5种方法提取福建山樱花叶片RNA，用琼脂糖凝胶电泳检测总RNA的完整性，以微量紫外分光系统检测总RNA的纯度和浓度。结果表明：Trizol法和天根试剂盒法不适于福建山樱花叶片RNA的提取；CTAB法和百泰克试剂盒法提取的RNA完整性好，纯度及浓度高，但百泰克试剂盒法提取的RNA有DNA污染；CTAB-LiCl法提取的RNA浓度低，且含杂质。RT-PCR试验结果进一步表明CTAB法提取的RNA能够用于后续的分子生物学研究，是福建山樱花叶片RNA提取的最佳方法。

福建山樱花；总RNA；提取方法

福建山樱花(PrunuscampanulataMaxim.)为蔷薇科樱属落叶乔木，花呈钟状下垂开展，颜色浓艳，花期早，每年春节前后开花，花期长达50 d，极具观赏价值[1]；且抗逆性强，适应性广，为园林绿化中不可多得的优良乡土观赏植物[2]。目前对福建山樱花及其近缘种的研究多集中在群落学特征、开花生物学、种源遗传多样性，以及引种适应区、繁殖技术、观赏性评价等方面[3]。而关于福建山樱花的分子生物学研究则鲜见报道。从分子水平研究基因变化，进行基因调控和定向分子育种，繁殖和培育出符合人们要求的优良品种，是福建山樱花今后研究的重要内容。高质量的RNA是Northern杂交、cDNA文库构建、基因表达分析等分子生物学研究的前提和基础。由于植物组织化学成分的差异，不同植物提取RNA的方法也不尽相同，关于提取植物RNA的文献很多[4-8]，但福建山樱花RNA的提取尚未见报道。本文对CTAB、CTAB-LiCl、Trizol、百泰克试剂盒、天根试剂盒5种方法提取的RNA进行比较分析，找出适合提取福建山樱花RNA的方法，为后续研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

供试材料为1年生盆栽福建山樱花嫩叶，现采现用，由福建农林大学工业原料林研究所提供。

1.2 RNA提取方法

1.2.1 Trizol法 嫩叶0.1 g加液氮研磨，转入1 mL预冷的Trizol提取液中，涡旋震荡2 min；4 ℃、12000 r·min-1离心10 min，吸取上清液；15～30 ℃下静置5 min，加氯仿200 μL，4 ℃、12000 r·min-1离心15 min，取上清液(此步骤重复1次)；上清液加异丙醇500 μL，颠倒混匀，15～30 ℃静置10 min，4 ℃、12000 r·min-1离心10 min，弃上清液，留沉淀；加 75%乙醇1 mL悬浮沉淀，4 ℃、7500 r·min-1离心5 min；干燥沉淀，用预热的RNase-free水溶解沉淀，-70 ℃保存备用。

1.2.2 CTAB法 嫩叶0.1 g加PVP液氮研磨，转入预热的CTAB缓冲液1 mL(2% CTAB+100 mmol·L-1Tris-HCl+25 mmol·L-1EDTA+2 mol·L-1NaCl+0.5 g·L-1亚精胺+2% PVP+3% 巯基乙醇)5 min混匀1次；4 ℃、12000 r·min-1离心15 min，转移上清液至新离心管中，加等体积的酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)，上下颠倒混匀5 min；4 ℃、12000 r·min-1离心10 min，转移上清液至新离心管，加等体积氯仿抽提混匀，冰浴5 min；4 ℃、12000 r·min-1离心10 min，转移上清液至新离心管，加2倍体积预冷的无水乙醇，上下颠倒混匀，-20 ℃沉淀2 h；4 ℃、12000 r·min-1离心15 min，弃上清液，用75%乙醇洗涤沉淀；4 ℃、10000 r·min-1离心10 min，弃上清液，干燥沉淀，用预热的RNase-free水溶解沉淀，-70 ℃保存备用。

1.2.3 CTAB-LiCl法 嫩叶0.15 g加PVP液氮研磨，转入预热的CTAB缓冲液1 mL，剧烈震荡混匀30 s，65 ℃水浴15 min，每隔2～3 min混匀1次；加氯仿0.4 mL，振荡10 min使其乳化，4 ℃、10000 r·min-1离心10 min；取上清液于新离心管中(重复上述操作1次)；取上清液于新离心管，加1/4体积的LiCl(10 mol·L-1)，4 ℃过夜(至少6 h)；4 ℃、10000 r·min-1离心15 min，弃上清液，加入250 μL RNase-free水溶解沉淀；加等体积的氯仿抽提2次；加2倍体积的无水乙醇，-20 ℃放置2 h；4 ℃、10000 r·min-1离心15 min，吹干沉淀10 min，RNase-free水溶解，-70 ℃保存备用。

1.2.4 百泰克试剂盒法 依照北京百泰克公司通用植物总RNA提取试剂盒(RP3301)说明书步骤进行。

1.2.5 天根试剂盒法 依照北京天根公司RNAprep Pure植物总RNA提取试剂盒(DP432)说明书步骤进行。

1.3 RNA质量、纯度检测

取RNA提取液1～2 μL，加4 μL RNase-free水稀释，以1.5 μL溴酚蓝染液染色，共7～8 μL点样电泳。电泳琼脂糖质量分数为1.2%，电压150 V，时间20 min。电泳完毕，在凝胶成像系统下观察RNA的完整性。取 RNA提取液1 μL，以NanoDrop 2000c微量紫外分光系统进行浓度及纯度检测，记录所得RNA的浓度，OD260/OD280、OD260/OD230值。

1.4 RT-PCR检测

参照Clontech公司的说明书对提取的RNA进行反转录及双链合成，取第一链2 μL作为模板，反应条件为95 ℃、1 min；95 ℃、15 s，65 ℃、30 s，68 ℃、6 min，18个循环；4 ℃结束反应。取PCR产物3 μL用1%琼脂糖凝胶电泳检测。

2 结果与分析

2.1 总RNA的纯度与质量浓度

以溶解RNA相应的DEPC水作空白对照进行调零，在NanoDrop 2003c上测得RNA质量浓度及纯度(表1)。

纯RNA 的OD260/OD280值为 2.0，当OD260/OD280<1.8时，表明蛋白质或其它有机物的污染比较明显；当OD260/OD280>2.2时，说明 RNA 已经水解成单核苷酸了。一般OD260/OD280值在1.8～2.1之间。OD260/OD230值若小于1.6，表明RNA有盐类等杂质的干扰；OD260/OD230大于1.6，RNA纯度较好。由表1可知，CTAB法、CTAB-LiCl法和百泰克试剂盒法提取的RNA的纯度均符合要求，但CTAB-LiCl法RNA质量浓度较低。Trizol法和天根试剂盒法提取的RNA，OD260/OD280、OD260/OD230值极低，蛋白和盐分残留严重，不适用于福建山樱花RNA的提取。

2.2 总RNA的质量

将5种方法提取的福建山樱花总RNA进行琼脂糖凝胶电泳，只有CTAB法、CTAB-LiCl法和百泰克试剂盒法提取的RNA电泳有条带出现，而Trizol法和天根试剂盒法提取的RNA未出现条带。CTAB法提取的RNA，其28 s条带的亮度几乎是18 s条带亮度的2倍，且几乎没有降解及DNA的污染，提取效果好(图1A)；CTAB-LiCl法提取的RNA电泳条带略暗，18 s处条带不够清晰，说明含有少量杂质，由于LiCl主要是沉淀大分子RNA，因而5 s条带不明显(图1B)；百泰克试剂盒法提取RNA，电泳条带清晰，几乎无降解，但DNA污染比较明显(图1C)，如果要进行下一步实验，必须先用DNase进行处理。

表1 不同方法提取的RNA纯度、质量浓度

图1 不同方法提取的RNA电泳图图2 RT⁃PCR产物cDNA电泳结果

2.3 3种福建山樱花总RNA提取方法优缺点比较

3种福建山樱花总RNA提取方法的优缺点见表2。CTAB法提取的RNA能够满足后续分子生物学实验的要求，但需时较长，步骤繁琐，试剂毒性大，操作时需要加倍小心；百泰克通用植物总RNA提取试剂盒若能充分去除DNA的干扰，也能达到预期目的，而且操作时间短，仅需30 min就能完成，但费用较高；CTAB-LiCl法操作时间最长，RNA浓度低且含有少量杂质，尽管可以通过加大样品量和细心操作来解决，但不建议使用。

表2 3种RNA提取方法的优缺点

2.4 RT-PCR分析

对CTAB法提取的RNA使用In-Fusion SMART cDNA文库构建试剂盒进行cDNA合成。从扩增结果(图2)可以看出，扩增得到的双链cDNA片段大小的分布范围是0.2～3 kb，大部分片段主要集中在0.4～1.5 kb之间，表明CTAB法提取的RNA可以用于后续的分子生物学研究。

3 结论与讨论

Trizol法简单方便，耗时较短，许多植物用Trizol法成功提取了RNA[9-10]，但此法不适合福建山樱花RNA的提取，可能是因为福建山樱花叶片多糖、多酚、次生代谢物质含量较高，Trizol类方法无法防止多糖多酚对RNA/DNA分相的干扰，会残留大量多糖、多酚或其他次级代谢产物。前人的研究结果也证实了Trizol法不适用于次生代谢物质多的植物[11-13]。天根试剂盒法的裂解液主要成分是异硫氰酸胍，是用胍盐促使核糖核酸酶变性而抑制其活性，从试验结果看，天根试剂盒法与Trizol法一样无法成功提取出RNA。

CTAB是一种强变性剂，被广泛应用于植物核酸提取，也被认为是适用于多糖、多酚类植物RNA提取的方法[14-16]，福建山樱花的同科植物苹果、桃、紫叶李等通过用改良的CTAB法均成功获得了高质量的RNA[17-19]。在CTAB法中协同使用了PVP和β-巯基乙醇，PVP作为多酚化合物的螯合剂，具有很强的结合酚的能力，β-巯基乙醇作为强还原剂也能防止多酚的氧化，二者协同作用有效抑制了酚类物质对RNA提取的影响[20]；提取缓冲液中的亚精胺可以抑制核糖核酸酶的活性。提取过程中使用酚、氯仿、异戊醇的抽提液结合长时间高速离心可以有效抽提去除蛋白质，再加入氯仿溶解脂肪并通过低速离心去除有机相从而去除脂肪。CTAB法耗时相对百泰克试剂盒法较长，但经济实用。

CTAB-LiCl法抽提步骤多，时间长，对于LiCl沉淀过后的产物仍需要用氯仿进行2次处理，2次沉淀，RNA很容易经多次抽提后损失殆尽，总的得率不高且降解度很大，不利于下一步试验的进行。

百泰克试剂盒法是一种专门用于RNA提取的试剂盒，采用柱式纯化的方式进行，操作简便快捷，提取的RNA的浓度、完整性均较高，但有DNA污染，若要获得高纯度的RNA，还需加入DNase 处理，与CTAB法相比，成本较高。

综合RNA的纯度、产量及经济方面考虑，CTAB法为福建山樱花叶片RNA提取的最佳方法，因此可采用CTAB法所提总RNA进行后续的逆转录试验。

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Comparison Study of Different Methods for total RNA Isolation fromPrunuscampanulataMaxim.

RONG Jun-dong1，ZHANG Ying-hui2，Xue Yi-min2，WANG Zhen-tian2，CHEN Ling-yan2，ZHENG Yu-shan1，2

(1.CollegeofForestry，FujianAgricultureandForestryUniversity，Fuzhou350002，Fujian，China；2.CollegeofLandscapeArchitecture，FujianAgricultureandForestryUniversity，Fuzhou350002，Fujian，China)

The performances of five extraction methods of total RNA which contain Trizol method，CTAB method，CTAB-LiCl method，Bio Teke RNApure Total RNA Plant kit and TIANGEN RNAprep Pure Plant Kit fromPrunuscampanulataMaxim.were compared in this research.The intrgrity of RNA were tested by agarose gel electrophoresis，the yields and quality of RNA were tested by micro ultraviolet spectrophotometer.It showed that both of Trizol method and TIANGEN RNAprep Pure Plant Kit weren’t suitable for total RNA isolation from leaves of P.campanulata.The CTAB and Bio Teke RNApure Total RNA Plant kit method could provide a high integrity and high yields total RNA，but there were traces of DNA pollution with Bio Teke RNApure Total RNA Plant kit.A lower total RNA yield and degradeted 18s RNA on gel electrophoresis were found in CTAB-LiCl method.RT-PCR amplification also showed that the quality of RNA isolated from CTAB method can meet the demands of molecular biology experiments.

Prunuscampanulata；total RNA；extraction methods

2014-03-03；

2014-04-25

福建省科技重大专项专题基金(2007SZ0001-8)

荣俊冬(1979—)，男，山东文登人，福建农林大学林学院助理研究员，从事森林培育研究。E-mail：rongjd@126.com。

郑郁善(1960—)，男，福建永泰人，福建农林大学教授，博士生导师，从事森林培育研究。E-mail：zys1960@163.com。

10.13428/j.cnki.fjlk.2015.01.015

S685.99；Q522

A

1002-7351(2015)01-0073-04