高效液相色谱法（HPLC）检测黄曲霉毒素B1的研究发展

2015-09-15卢朝婷林巧巩发永肖诗明

南方农业·下旬 2015年8期

卢朝婷林巧巩发永肖诗明

摘要由于黄曲霉毒素是一种毒性极强的剧毒物质，因此人们对它的关注越来越广，不断对高效液相色谱法进行改进与提高，以求得最用快速、简洁、节约的方法求得最精确的结果。基于此，利用高效液相法，通过使用不同的前处理、净化、衍生、检测等手段从不同角度对食品中的黄曲霉B1毒素进行检测，发现以甲醇-水为提取液、用多功能净化柱净化，通过柱后衍生在发射波长为440 nm、激发波长为360 nm时对黄曲霉毒素B1的检出限最大。

关键词高效液相色谱；黄曲霉毒素；检测技术

中图分类号：TS207.3；O657.72F592.7 文献标志码：B 文章编号：1673-890X（2015）24--03

黄曲霉毒素（Aspergillus flavus toxin，AFT）是因为1960年火鸡事件而被发现，黄曲霉毒素已经被分离出的有20多种，，其除了包含黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2、M1、M2、等外，尚有多种黄曲霉毒素的代谢产物、异构物和相似物等。其中，以黄曲霉毒素B1（AFB1）污染的食品人体的毒性作用是非常严重的。并且根据人们大量的实验发现：黄曲霉毒素的毒性是氰化钾毒药的10倍之多，更是砒霜的68倍[1]，除了毒性，黄曲霉毒素的致癌性是二甲基硝胺的75倍，是奶油黄的900倍。黄曲霉毒素不仅会引发肝癌，也可能引发肿瘤和各种疾病，通过镜检观察霉菌的菌丝和孢子的形态特征、孢子排列、以及菌落生长特征等一系列方式，是进行产毒黄曲霉毒素的主要检测方法。鉴定出菌株的基础上再进行毒素的检测。如今人们经常用来检测的黄曲霉毒素的方法一般为以下几种：薄层色谱法（TLC）；免疫学方法如：酶联免疫吸附法（ELISA）、放射免疫法（RIA）、免疫层析法；高效液相色谱法（HPLC）；免疫学与仪器结合法如：免疫亲和柱-荧光粉光光度法、免疫亲和柱-HPLC；快速测定法如：金标免疫层析法等[2]。本文主要介绍了高效液相色谱法检测黄曲霉毒素B1的研究进展，以及通过使用不同的萃取、净化、衍生或改变净化衍生等试验顺序来探讨HPLC法对试验结果的影响。

1 样品前处理方法

样品预处理通常是将采集好的样品的提取和纯化。通过不同的净化柱和衍生处理方法，得到的检出限是不同的。常用的前处理的方法有：乙腈水溶液萃取、甲醇-水溶液萃取和二次萃取。

1.1 液液萃取法（LLE）

在传统的液液萃取法中，因为毒素在两种不相互溶解的溶剂中的溶解度不同，因此能将毒素从一种溶剂中转移到另一种溶剂中，通过重复几次萃取，将绝大多数的AFT提取出来。于是，一般通过使用甲醇-水、乙腈-水等有机溶剂提取[3]。吴国华等利用60%乙腈-水溶液萃取样品中的黄曲霉B1毒素作为试验前处理，摇床混合30min后，通过槽纹滤纸对滤液进行过滤，然后再滤液加入0.1%的吐温/PBS稀释后使用玻璃纤维滤纸对滤液进行过滤，直至滤液澄清为止。然后用免疫亲和柱进行净化，得到的结果是：在线性范围内，液相法的标准曲线相关系数R2=0.999 2，回收率为93.7%[4]。张继斌、汪永曾等在前处理时利用甲醇+水（70+30，V/V）溶液萃取样品中的黄曲霉B1毒素，并用高速均质器均质1～2 min，用中速定性滤纸过滤，收集滤液后用免疫亲和柱净化。使用这种前处理的方法得到的结果是：黄曲霉B1毒素的定量限为0.2 μg/kg[5]。对于脂肪含量较高的样品可先加乙醚等溶剂。

1.2 固相萃取（SPE）

固相萃取使近几年由以前的萃取技术相结合发展起来的。它的优点是较LIE法来说提高了AFT的回收率，能更有效的将AFT与干扰组分分离，而且操作简单，是目前使用最广泛的萃取方法之一[6]。Quinto等将小麦粉中的AFT经过使用甲醇-磷酸缓冲溶液提取出来，然后用柱后光化学衍生荧光进行检测，然后净化、浓缩。通过采用这种方法发现FAB1的定量限为0.1～0.63 μg/kg，且在这个范围内有良好的线性关系[7]。

1.3 超临界流体萃取（SFE）

CO2是超临界流体萃取最常用的提取剂，但由于这种单组分液体中的溶解度和选择性有很大的局限性，因此，为了提高提取效率，通常要加入适当的改良剂，来增强AFT在流体中的溶解度和选择性。由liau的试验可以看出，虽然此方法的最低检测限较好，但是比起其它方法来说，PFE的成本高，需要专门的设备等一系列原因，因此不适合作为提取AFT的常规方法[8-9]。

1.4 二次提取

二次提取也可以提高复杂机制的检测效率。例如，Vega分析了花生酱中黄曲霉毒素的含量。具体的操作方法：待测物先用15%氯化钠的甲醇溶液提取，然后再用甲醇进行二次提取，结果发现B1的回收率是95.2%[10]。

2 衍生方法

当分析物不能及时直接检测到的，通常需要将待测物质与衍生剂发生反应，产生一些如荧光特性可检测的物质。当检测出带荧光的物质后，经过检测衍生产物最后来确定待测物质。常用的衍生方法有：柱后衍生法、柱前衍生方法等。

2.1 柱后衍生法

柱后衍生方法主要包括柱后溴衍生和柱后碘衍生两种方法。龙凌云、刘胜利等在检测黄曲霉毒素的实验中通过利用ECOSIL HPLC COLUMN（250 mm×4.6 mm，5μm）的色谱柱，将流动相定为：乙腈-甲醇-水（30∶60∶10）混合溶液，控制进样量和流速分别为：10 μL和1.0 mL/min。方法采用柱后衍生检测样品溶液，在0.05%碘溶液浓度的作为衍生物溶液，将衍生泵流量0.3 mL/min，和激发波长荧光检测器设置在360 nm，发射波长设定为450 nm。得到的结果检出限和定量限分别是AFB1 0.12 μg/kg和0.40 μg/kg[11]。刘柱、陈万琴等人，利用乙腈-水（体积比86∶14）为提取液，将样品经提取后，经多功能净化柱净化。以甲醇、乙腈和水溶液作为流动相对样品进行梯度洗脱，而后在选用C18柱分离，用C18柱分离样品溶液后，经过在线光化学衍生，并且需要将荧光和二极管阵列测器同时进行测定。在这种操作情况下，发现黄曲霉B1毒素的检出限为0.02 μg/kg[12]。

2.2 柱前衍生法

付成平等人发现在使用三氟乙酸的方法对中草药提取物的黄曲霉毒素B1进行柱前衍生化实验的测定，采用柱前三氟乙酸衍生的检出限为0.1 μg/kg，回收率为80% ～110%[13]。虽然柱前衍生法的灵敏度高，但是由于这种方法的操作繁琐且稳定性不高，因此现在使用这种方法的人越来越少了。

3 检测方法

高效液相色谱法检测黄曲霉毒素B1的方法往往有：柱后碘衍生-高效液相色谱法、柱后溴衍生-高效液相色谱法、柱后光化学衍生化荧光反应以及柱前三氟乙酸衍生-高效液相色谱法等几种不同的方法。因为不同的样品使用不同的检测方法得到的结果可能会不太一样，所以要尽可能的避免影响试验结果的因素。尽管按照各种不同的试验发现黄曲霉B1毒素的荧光强度较弱，可是由于荧光检测器具备高灵敏度、高选择性及干扰峰少等长处。因此，荧光检测器的反向HPLC法亦在大量的研究当中，成为近代检测黄曲霉毒素的主要方法。但由于黄曲霉B1毒素的荧光度较弱，若直接测定荧光度会影响实验的灵敏度和准确度，但是衍生可增强黄曲霉B1毒素的荧光强度。

3.1 柱后衍生荧光化荧光检测

彭志兵等人对样品经过液液萃取精华的前处理方式将黄曲霉毒分离后，采用柱后碘衍生的处理方法，并使用高效液相色谱荧光检测器测定粮食中的黄曲霉毒素。结果发现利用该方法不仅检测时间短，仅在24 min内完成测试，而且黄曲霉毒素线性关系的r值均高于0.999 5，回收率为80.3% ～97.0%，检出限小于0.40 μg/kg[14]。这种方法不仅线性关系好，而且回收率较高，速度较快，更能满足于人们对黄曲霉毒素的检测所追求的快速和精准。

3.2 柱后光化学衍生化荧光检测

邱文倩、傅武胜等利用柱后光化学衍生，将样品经提取、免疫亲和柱净化后，以甲醇-水为流动相，经柱后光化学衍生并通过荧光检测器定量，结果得出：通过采用柱后衍生的方法得到的黄曲霉毒素的回收率为94.2%～97.5%，相对标准偏差为3.6%～5.8%[15]。我们能够看出利用这种方法的重复性好，并且有灵敏度高，能满足食品中黄曲霉毒素基本的定性定量的检测要求。

3.3 柱前三氟乙酸衍生化荧光检测

在柱前三氟乙酸衍生荧光检测是国家标准GB/T 5009.23-2006 中的第三法。这种方法的原理是使用乙腈-水溶液将试样中的黄曲霉毒素进行提取，然后将提取液过滤后，经过装有反相离子交换吸附剂的多功能净化柱，目的是为了去除脂肪、蛋白质等干扰物质。通过使用三氟乙酸溶液对净化液中的黄曲霉毒素进行衍生，并且通过附有荧光检测器的液相色谱系统对此反应进行分析，然后用外标法进行定量[16]。但由于其操作繁琐，稳定性弱，样品吹干易造成损失。因此，人们渐渐开始使用检测黄曲霉毒素的柱后衍生化方法。

试验发现采用柱后衍生法的优点是准确、灵敏度高、简便能够满足食品中黄曲霉毒素定性定量检测要求

4 方法学分析

瑞丰等利用三氟乙酸在40 ℃条件下衍生15 min后定容，在荧光检测器下检测，发现样品的回收率在72%～82.3%，检出限为0.002 μg/kg[17]。毕瑞峰等人通过用串联质谱的检测方法发现，样品经处理后用电喷雾离子化三重四级杆串联质谱测定，发现在各自的线性范围内，峰面积与其浓度的线性关系良好，其检出限、定量限和平均回收率分别为0.009～0.04 μg/kg、0.03～ 0.12 μg/kg、63.0%～78.5%[18-19]。王新丽等人在试验中通过利用高效液相色谱柱对样液进行分离后，将样品经过柱后衍生装置并且与碘溶液发生反应，最后进入荧光检测，结果发现，使用该方法对黄曲霉毒素B1的检出限为0.03 μg/kg，定量限为0.1 ng/ mL，低、高浓度的回收率分别为：82.3%，85.7%[20]。由前人们的大量试验及结果分析，我们可以看出，通过采用柱后衍生的方法在发射波长、激发波长分为440、360nm时对黄曲霉毒素B1的检出限最大。

5 结语

因为黄曲霉毒素对人体的危害巨大，受到全世界的广泛关注且人们对食品质量安全意识的逐步增加，全国政府对食品中的黄曲霉毒素特别是AFB1的含量要求越来越严格。不断的推动了AFB1的检测方法的研究进展。黄曲霉毒素的检测方法层出不穷，其中以高效液相色谱法使用最为广泛，受人们研究最多，产生了许多种不同的方法对样品进行取样、净化、衍生等，对不同类型的食品使用不同的处理方法，以求使结果最为准确，过程最为简洁，效率最高。

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