脑蛋白水解物原料肽含量测定方法的改进

张苏闽　汤晓枢　周媛媛（上海长城药业有限公司　上海　201707）

脑蛋白水解物原料肽含量测定方法的改进

张苏闽汤晓枢*周媛媛
（上海长城药业有限公司上海201707）

目的：优化脑蛋白水解物原料肽含量测定方法。方法：采用Agilent Zorbax Eclipse-AAA色谱柱（4.6 mm×150 mm, 5 mm）, 流动相A：0.04 mol/L磷酸盐缓冲液（pH 7.80）, 流动相B：乙腈-甲醇-水（45∶45∶10）, 流速1.5 ml/min, 柱温40 ℃, 检测波长：338 nm, 262 nm, 梯度洗脱。结果：各种氨基酸的浓度在15.0～120.0 mg/ml范围内与峰面积呈良好的线性关系（r＞0.999）, 各种氨基酸的平均回收率为98.1%～103.6%。结论：该方法快速、简便、专属性强、重复性好, 结果准确可靠, 适用于脑蛋白水解物原料肽含量的测定。

脑蛋白水解物原料肽含量测定氨基酸高效液相色谱

脑蛋白水解物原料（国药准H31023028）为我们公司原料药车间生产的原料药，系健康猪的鲜大脑经脱脂和水解而成。2013年6月28日国家药典委员会发布了《关于脑蛋白水解物原料国家标准的公示稿》，明确了需进行脑蛋白水解物原料肽含量的测定，即需对脑蛋白水解物原料中游离及水解氨基酸含量进行测定，并用于计算肽含量（肽含量=水解氨基酸含量-游离氨基酸含量）。

大多数氨基酸不含有芳香环等生色团，无紫外吸收，需要先将氨基酸衍生为具有较强紫外或荧光吸收的衍生物[1]。氨基酸HPLC柱前衍生化的分析方法有多种，以Waters AccQ·Tag衍生法[2-4]、OPA-FMOC（邻苯二甲醛—9-芴甲基氯甲酸酯）衍生法测定氨基酸最为常用[5-7]。本公司曾用OPA-FMOC衍生法测定脑蛋白水解物原料中游离及水解氨基酸含量（色谱柱Hypersil ODS-C18：4.6 mm×100 mm，5 mm，流动相A：pH 7.20的醋酸盐缓冲液，流动相B：pH 7.20的醋酸盐缓冲液-乙腈-甲醇，梯度洗脱）。但我们发现该种色谱条件在分析检测氨基酸时存在以下问题：①在同时分离16种氨基酸时，部分氨基酸分离度差，系统适用性不佳；。②测定方法的重现性差；③进行梯度洗脱的A、B相盐浓度高，直接影响色谱柱的使用寿命；④该系统对pH较敏感，配制A、B相pH误差会直接影响氨基酸的分离。本研究参考文献优化了脑蛋白水解物原料肽含量测定的方法[8]。

1　仪器与试药

Agilent 1100液相色谱仪，DAD检测器、自动进样器（安捷伦科技中国有限公司）。Sartorius BP121S电子天平（赛多利斯科学仪器北京有限公司）。16种氨基酸对照品（批号：140624-200805，中国药品生物制品检定所）。脑蛋白水解物原料（批号：20101102）为本公司产品。甲醇、乙腈为色谱纯，水为超纯水，磷酸氢二钠及其他试剂均为分析纯。

2　方法与结果

2.1色谱条件

Agilent Zorbax Eclipse-AAA色谱柱（4.6 mm×150 mm，5 mm），流动相为A：0.04 mol/L磷酸盐缓冲液（pH 7.8）(取磷酸二氢钠（NaH2PO4·2H2O）6.24 g，加水1 000 ml溶解，用5 mol/L的氢氧化钠溶液将pH调至7.80±0.05)；流动相B：乙腈-甲醇-水（45∶45∶10），按表1进行梯度洗脱。柱温：40 ℃。检测波长：338 nm，262 nm。流速：1.5 ml/min.。

表1 梯度洗脱

2.216种氨基酸对照品溶液的配制

对照品溶液的制备：称取16种氨基酸对照品各约30 mg，至100 ml容量瓶中，以0.04 mol/L盐酸溶液溶解至刻度（对照品贮备液），再精密量取2 ml，至10 ml容量瓶中用水稀释至刻度，摇匀，备用。

2.3供试品溶液的配制

游离氨基酸含量测定供试品溶液：精密称重脑蛋白水解物原料300 mg，置100 ml容量瓶中，加水溶解并超声10 min，加水稀释至刻度，滤过，取续滤液作为游离氨基酸含量测定供试品溶液。

水解氨基酸含量测定供试品溶液：精密称取脑蛋白水解物原料200 mg，置硬质安瓿中，加盐酸2 ml，摇匀，充氮封口，于110 ℃水解20 h，放冷，启封后溶液置蒸发皿中，水浴蒸发至干，加水使残留物溶解并稀释至100 ml，作为水解氨基酸含量测定供试品溶液。

2.4衍生化程序

采用Agilent液相色谱仪自带的柱前衍生的方法，设定进样程序，对所得的氨基酸样品进行衍生化反应，进样器程序设定见表2。

表2　衍生进样程序设定

氨基酸衍生试剂配制方法：

小瓶 1：8 mg/ml邻苯二甲醛（OPA）溶液：精密称取80 mg邻苯二甲醛（OPA），依次加入7 ml硼酸缓冲液溶液、1 ml乙腈和125 ml 巯基丙酸，摇匀并溶解，即得。

小瓶 2：5 mg/ml 9-芴甲基氯甲酸酯（FMOC）溶液：精密称取50 mg 9-芴甲基氯甲酸酯（FMOC），用乙腈溶解并稀释至10 ml，摇匀并溶解，即得。

小瓶 3：双重蒸馏水。

小瓶 4：硼酸缓冲液：精密称取1.236 g硼酸至50 ml容量瓶中，加水超声至全部溶解，用40%氢氧化钠溶液调节pH至10.2，即得。

2.5方法学考察

2.5.1系统适用性试验

取需测定的16种氨基酸的对照品：门冬氨酸(Asp)、谷氨酸(Glu)、丝氨酸(Ser)、组氨酸(His)、甘氨酸(Gly)、苏氨酸(Thr)、精氨酸(Arg)、丙氨酸(Ala)、缬氨酸(Val)、甲硫氨酸(Met)、色氨酸(Trp)、异亮氨酸(Ile)、苯丙氨酸(Phe)、亮氨酸(Leu)、盐酸赖氨酸(Lys)、脯氨酸(Pro)，依法配制对照品溶液，衍生后进样，进行系统适用性试验（图1）。

图1 色谱条件改进前后16种氨基酸系统适用性试验色谱图

从图1A可见，在该色谱条件下，需测定的16种氨基酸均能完全分离，峰形佳，较图1B中原色谱分离条件有了明显的改善。分离度数据显示（表3），改进前16种氨基酸的分离度未完全达到药典规定的分离度要求，缬氨酸与甲硫氨酸、亮氨酸与赖氨酸的分离度仅大于1.0，且甘氨酸与苏氨酸未完全分离。经色谱条件改进优化后各氨基酸的分离度均大于1.5，分离效果明显改善，实现了16种氨基酸在同一色谱条件下的完全基线分离。

表3　16种氨基酸峰分离度

2.5.2线性范围

分别取16种氨基酸对照品配制成一系列浓度的混合对照品溶液，分别取上述对照品溶液衍生后进样，并计算16种氨基酸的线性回归方程（表4）。

表4　16种氨基酸线性试验

结果显示，16种氨基酸的浓度在约15.0～120.0 mg/ml范围内与峰面积呈良好的线性关系（r＞0.999）。

2.5.3精密度试验

分别取16种氨基酸对照品溶液衍生后连续进样6次，结果见表5。

连续进样6次16种氨基酸峰面积偏差的RSD均＜2.0%。可知该色谱条件下氨基酸测定方法的精密度较好。

2.5.4重复性试验

取同一批供试品，依法制备游离氨基酸和水解氨基酸供试品溶液各6份，衍生后分别测定游离、水解氨基酸的含量，并分别计算脑蛋白水解物原料肽含量（表6）。

由表6结果可知：肽含量均值为419.5 mg/g，RSD小于2.0%，表明采用该方法测定脑蛋白水解物原料肽含量重复性较好，测定结果可靠。

2.5.5溶液稳定性试验

取制备的游离氨基酸和水解氨基酸供试品溶液，分别于0、2、4、8、12、18、24 h衍生并进样检测，以0 h进样样品的含量为100%，比较供试品溶液中各氨基酸的日内稳定性(表7)。

表5　脑蛋白水解物原料肽含量测定精密度试验

表6　脑蛋白水解物原料肽含量测定重复性试验（mg/g）

表7　脑蛋白水解物原料供试品溶液稳定性试验(%)

结果显示，游离和水解供试品溶液中所含16种氨基酸在24 h内的含量变化的RSD均小于2.0%，表明供试品溶液在24 h内稳定，含量测定结果可靠。

2.5.6加样回收试验

取供试品适量，按照高（120%）、中（100%）、低（80%）三个浓度加入含16种氨基酸的对照品储备液，依法制备加样回收的供试品溶液，每个浓度各3份。取上述加样溶液衍生后进样，并计算加样回收率(表8)。

结果表明，游离、水解氨基酸含量测定中16种氨基酸的回收率均在98.1%～103.6%范围内，RSD均小于2.0%，证明本方法回收率结果良好。

2.6样品测定

取不同批次的脑蛋白水解物原料，依法制备游离、水解供试品溶液，并衍生化进样。测定并计算肽含量（表9）。

表8　脑蛋白水解物原料肽含量测定加样回收试验(%)

表9　脑蛋白水解物肽含量测定（mg/g）

3　讨论

3.1检测器的选择

OPA-FMOC衍生法测定氨基酸，其中一级氨基酸（Asp、Glu、Ser、His、Gly、Thr、Arg、Ala、Val、Met、Trp、Ile、Phe、Leu、Lys共15种）首先与OPA反应，形成OPA-氨基酸，在338 nm下有最大吸收。二级氨基酸（Pro）则与FMOC衍生生成FMOC-氨基酸，在262 nm下有最大吸收。因加入吲哚与3-巯基丙酸相结合降低了氨基酸的疏水性，所以OPA衍生化产物较FMOC衍生化产物色谱出峰时间较早。

在原有方法中，我们选用VWD检测器进行检测，并在一级氨基酸中最后出峰的盐酸赖氨酸(Lys)出峰后设置一个波长切换，检测波长由338 nm切换至262 nm，用于检测二级氨基酸的脯氨酸(Pro)。该方法对使用的紫外检测器要求不高，但因波长切换导致检测器的急速光栅变化，脯氨酸(Pro)出峰时检测器未必达到稳定的状态，且在波长切换时如基线发生抖动，会在图谱上形成一个较大的上升、下降平台，使得262 nm下脯氨酸检测数据不稳定。故我们建议采用DAD检测器进行两级氨基酸的检测，即分别连续收集338 nm和262 nm两个波长的信号，这样保证了一级、二级氨基酸同时检测的准确性。

3.2参比波长的设定

在Agilent Zorbax Eclipse-AAA色谱柱说明书中，明确规定了氨基酸检测参比波长的设定，参比波长的设定参数如下：338 nm：10 nm带宽（bw），参比波长：390 nm，20 nm带宽（bw）（适用于OPA-氨基酸）；262 nm：16 nm带宽（bw），参比波长：324 nm，8 nm带宽（bw）（适用于FMOC-氨基酸）。峰宽：＞0.03 min（0.5 s）。狭缝间距：4 nm。

在方法优化过程中我们进行了相关比对试验，对比了其与工作站默认参比波长设置的区别，结果显示采用这种参比波长的设定，对于氨基酸检测的图谱起到了明显的优化作用，设定后梯度洗脱条件下色谱图的基线较未设定前更平稳，不再有明显漂移。各氨基酸峰的对称性也有改善，峰型更佳。从而提高了多种氨基酸含量测定的准确性（图2）。

图2　参比波长优化前后16种氨基酸的分析图谱

3.3流动相的改进

原方法中使用的流动相存在以下问题：①流动相A为pH 7.20的醋酸盐缓冲液，流动相B为pH 7.20的醋酸盐缓冲液-乙腈-甲醇，两相均为较高浓度的盐溶液，对色谱柱、液相泵的使用寿命影响较大；②流动相B为盐溶液与有机溶剂的混合溶液，该混合溶液为不稳定体系，在分析过程中可能会有盐析出，影响氨基酸的分离；③该系统对流动相pH非常敏感，要求我们配制A、B相的pH误差范围应为7.20±0.05，如有误差则会影响各氨基酸的分离度。

改进后的色谱条件A相为一定浓度的磷酸盐溶液，B相则为不含盐的乙腈、甲醇、水的混合液，降低了对色谱柱、液相泵的损耗。且该系统对流动相的pH敏感性较低，pH的误差对氨基酸分离的影响不大，也大大提高了流动相配制的便捷性。

3.4盐酸对于色谱柱的损耗

色氨酸、丙氨酸、缬氨酸、甲硫氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸和脯氨酸为疏水氨基酸，均难溶于水，在原有操作规程中我们采用0.04 mol/L盐酸溶液作为溶剂配制对照品溶液。在大量的试验过程中，我们发现盐酸对于色谱柱存在损耗，使得色谱柱柱效下降，寿命缩短。故我们改进了对照品溶液的配制方式。先将以上氨基酸配制为高浓度的对照品贮备液（配制浓度为测试浓度的5倍，溶剂为0.04 mol/L盐酸溶液），使其完全溶解，再使用双蒸水稀释至合适浓度，这种配制方式大大降低了对照品溶液中盐酸的浓度，更好的保护了色谱柱。

在水解氨基酸样品前处理时，我们需将脑蛋白水解物原料用浓盐酸水解后制备供试样品溶液。在处理过程中我们将酸水解后的样品水浴蒸干，再使用双蒸水溶解并稀释。这一过程的目的同样是将供试品中的盐酸尽可能去除，起到保护色谱柱的作用。

4　结论

经方法学验证，本研究所建立的肽含量测定方法操作简便、专属性强，能准确测定脑蛋白水解物原料中肽的含量。

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Optimization of a method for the determination of peptide content in cerebroprotein hydrolysate

ZHANG Sumin, TANG Xiaoshu*, ZHOU Yuanyuan
(Shanghai Greatwall Pharmaceutical CO. LTD., Shanghai 201206, China)

Objective: To optimize a method for the determination of peptide content in cerebroprotein hydrolysate. Methods: HPLC was performed on an Agilent Zorbax Eclipse-AAA column（4.6 mm×150 mm, 5 mm）with mobile phase A: 0.04 mol/L phosphate buffer (pH 7.8) and mobile phase B: acetonitrile-methanol-water (45：45：10) at UV detection wavelength of 338 nm and 262 nm, flow rate of 1.5 ml/min (gradient elution) and column temperature of 40 ℃. Results: The standard curve of every amino acid was linear over the range of 15.0~120.0 mg/ml (r＞0.999）with average recovery 98.1%~103.6%. Conclusion: This method is simple, accurate, sensitive and reproducible, and can be applied in the determination of peptide content in cerebroprotein hydrolysate.

cerebroprotein hydrolysate; determination of peptide content; amino acids; HPLC

R927.2; O657.72

A

1006-1533(2015)13-0074-06

汤晓枢(1979-), 男, 工程师, 从事化学与生化药品研发工作。E-mail: tangxiaoshu_1979@126. com

2015-03-03)