利用新型DNDF7和携带LoxP位点的LPL4质粒快速构建S-Sox5基因打靶载体*

刘晙玭汪智琼平光伦石玉琴张 玲张志兵，3

1 武汉科技大学医学院公共卫生学院（武汉 430065）； 2. 华中科技大学同济医院血液科；

3. Department of Obstetrics & Gynecology， Virginia Commonwealth University， Richmond， VA， 23298. USA

利用新型DNDF7和携带LoxP位点的LPL4质粒快速构建S-Sox5基因打靶载体*

刘晙玭1汪智琼2平光伦1石玉琴1张 玲1**张志兵1，3**

1 武汉科技大学医学院公共卫生学院（武汉 430065）； 2. 华中科技大学同济医院血液科；

3. Department of Obstetrics & Gynecology， Virginia Commonwealth University， Richmond， VA， 23298. USA

目的 体外实验已证实S-SOX5蛋白转录调节运动纤毛基因Spag6，为进一步探索其在体内的作用，拟构建S-Sox5基因的敲除载体。方法 利用新型DNDF-7和携带LoxP位点的LPL4载体，选择S-Sox5基因第1外显子作为条件性敲除目的片段，SV129系ES细胞DNA 为模板分步扩增包括S-Sox5第1外显子的中间段（middle piece），上游同源左臂4.8kb（upper arm）及下游同源右臂2.5kb（down arm）的基因片段；构建upper-arm-DNDF7、down-arm-DNDF7和middle-piece-LPL4质粒，将middle-piece-LPL4的酶切产物LoxP-middle-piece-LoxP和down-arm-DNDF7酶切产物相连，形成携带LoxP位点的middle-down-arms-DNDF7重组质粒，该质粒与upper-arm-DNDF7酶切产物相连，获得S-Sox5基因打靶载体。结果 经酶切鉴定及测序证实，构建的upper-arm-DNDF7、middle-piece-LPL4、down-arm-DNDF7重组质粒和S-Sox5基因打靶载体结构正确，与设计相符。结论 成功构建小鼠S-Sox5条件基因打靶载体，为进一步建立S-Sox5条件敲除小鼠，在体内研究其功能打下基础。

S-Sox5基因； 基因打靶载体； DNDF7载体； LPL4载体

SOX蛋白是一组拥有一个或多个DNA结合结构域即高迁移率组蛋白（high motility group，HMG）DNA结合区域的蛋白家族，它们能通过HMG结构域与DNA结合。SOX蛋白通过结合DNA而激活或抑制基因表达，调节不同的生理发育过程，如肌肉、血管、B细胞发育等，SOX蛋白与许多疾病发生有关［1-4］。

SOX 家族可分为10 组，从A组到J组［5］。其中，SOX5 是SOXD 亚家族的一员，该亚家族有3个基因，SOX5、SOX6和 SOX13［6］。 小鼠Sox5 主要转录两种转录子， 一个短的转录子（2 kb），在睾丸表达［7］，命名为S-Sox5，翻译 48 kDa的S-SOX5蛋白；另一个长的转录子（6 kb），在其它组织表达［8］，6 kb转录子最初被命名为L-Sox5，现简称为Sox5，与神经系统发育及多种癌症的发生相关［9，10］。

研究表明，S-SOX5 可调节运动纤毛表达丰富的睾丸组织中一些基因的表达，如 激素敏感脂肪酶（hormone-sensitive lipase）、核因子kappaBβ亚族的抑制蛋白IkappaBβ和锌指蛋白230（zinc finger protein，ZNF230）［11-13］等。除睾丸组织外，人S-SOX5在运动纤毛表达丰富的脑组织也高度表达［14］，提示S-SOX5与运动纤毛有着密切的联系，可能是一个调节运动纤毛基因功能的转录因子。我们前期实验也证明，在支气管源性细胞（Bronchial Epithelial Cell Line，BEAS-2B）中， S-SOX5可激活小鼠和人精子相关抗原6（sperm associated antigen 6，SPAG6）启动子功能，将SPAG6启动子区域S-SOX5结合位点突变或缺失后，其对SPAG6的活化效应随之消失［15］。目前已知全长Sox5已有多种变异体（variants），但非常特别的是，我们选择性分析小鼠L-Sox5 variant 1、variant 2和S-Sox5的外显子后发现， S-Sox5的第1外显子并未在L-Sox5 variant1、variant2中出现，而S-Sox5第2～8外显子分别对应L-Sox5 variant2的8-14外显子， S-Sox5的第1外显子（exon 1）不编码蛋白，其转录子从第2外显子才开始翻译［15］。因此这个特异的第1外显子为进一步探索S-Sox5影响运动纤毛形成及功能的作用机制提供了可能。本研究通过利用新型载体DNDF7及已携带2个LoxP位点的LPL4质粒，通过传统的PCR扩增、酶切和连接技术，快速构建S-Sox5基因第1外显子的完全敲除打靶载体，为后续的构建并利用S-Sox5基因敲除小鼠模型、深入研究S-Sox5的功能奠定了基础。

材料与方法

一、材料

（一）质粒

质粒：DNDF7、LPL4 vector由美国弗吉利亚联邦大学Ching-kang Chen教授惠赠。

（二）实验试剂

限制性内切酶EcoRⅠ、BglⅡ、XhoⅠ、BamHⅠ、SalⅠ、KpnⅠ、NotI、和AvrⅡ购自New ENGLAND Biolabs公司（Ipswich， Massachusetts，USA）；TOPO10 pcr 2.1 TA cloning Kit、SOC培养基、DH5α购自Invitrogen公司（Carlsbad， California，USA）；QIAprep®Spin Minipred Kit （Cat. No. 27104）、QIAquick®Gel Extraction Kit（Cat. No. 28706）和EndoFree®plasmid Maxi Kit （Cat. No. 12362）购自Qiagen公司（Valencia， California，USA）；Expand Long Template PCR system（Cat. No. 11681834001）、Expand High Fidelity PCR system（Cat. No. 11732650001）、Rapid DNA Ligation Kit（Cat. No. 11635379001）购自Roche Diagnostics公司（Indianapolis， Indiana， USA）。

二、S-Sox5基因的生物信息学分析及同源臂的引物设计与合成

依据GenBank中小鼠S-Sox5基因序列（在EMBL数据库中的序列号为X65657［7］，BLAST软件标注其8个外显子与起始密码子，选择第1外显子前后各15kD的序列，分析基因组重复序列的大小和具体位置，在避开重复序列的前提下， 进行基因敲除的设计。所有PCR引物自行设计并引入相应的酶切位点，见表1。

表1 引物序列及引入的酶切位点

设计打靶载体的5’同源臂（上游同源臂，Upper/Left arm）长约4.8kb，含基因敲除区域exon1的中间臂长约748bp（中间臂，Middle piece），3’同源臂（下游同源臂，Down/Right arm）长约2.5kb。上述引物均由Invitrogen公司合成。

三、Upper-arm-DNDF7、middle-piece-LPL4和down-arm-DNDF7重组质粒构建

以SV129系小鼠胚胎干细胞（embryonic stem cell，ES细胞）DNA为模版，用相应引物分别扩增上游、中间和下游同源臂对应的约4.8kb、748bp和2.5kb的基因片段。反应体系如下：上下游同源臂：10×PCR 缓冲液③ 5μL；10 mmol/L dNTPs 2.5μL；2 μM P1/P2或P5/P6各10 μL；DNA 1μL；Taq DNA聚合酶1μL；加ddH2O 20.5μL至50μL。反应条件如下：94℃预变性2 min；94℃变性15 s，60℃退火30 s，68℃延伸6 min，10个循环；94℃变性15 s，60℃退火30 s，68℃延伸6 min+20 s/循环，25个循环；68℃延伸7 min，使用Expand Long Template PCR system进行。扩增产物经0.7%琼脂糖凝胶电泳后，回收获得4.8/2.5kb目的基因片段。中间臂：10×PCR 缓冲液② 5μL；dNTPs 1μL；2 μM P3/P4各8 μL；DNA 1μL；Taq DNA 聚合酶1μL；加ddH2O 26μL至50μL。反应条件如下：95℃预变性5 min；95℃变性30 s，60℃退火45 s，72℃延伸1′30″，30个循环；72延伸10 min，使用Expand High Fidelity PCR system进行。扩增产物经0.7%琼脂糖凝胶电泳后，回收获得748bp目的基因片段。

上、中、下游同源臂对应目的基因片段经TA克隆，分别经BglII+XhoI、BamHI+SalI、KpnI+AvrII酶切后，分别连入DNDF7、LPL4和DNDF7载体中。

四、LoxP-middle piece-LoxP/down-arm重组质粒的构建

将两端携带LoxP位点的Middle-piece-LPL4质粒经KpnI+NotI酶切，产物与down-arm-DNDF7质粒相连，取连接产物转化E. coli DH5α感受态细胞，挑取克隆提取质粒，分别用KpnI+NotI和KpnI+AvrII双酶切鉴定重组质粒。

五、S-Sox5条件基因打靶载体的构建与鉴定

将upper arm-DNDF7载体和LoxP-middle-LoxP/ down-arm重组质粒分别经NotI+AvrII酶切后相连，连接产物转化E. coli DH5α感受态细胞，随机挑取克隆提取质粒，酶切 和测序鉴定S-Sox5条件基因打靶载体（conditional gene targeting vector， S-Sox5 KO）。

送测序质粒主要鉴定LoxP位点是否成功插入，引物如下：LoxP Forward：5’-TTA CAA GCA TAG AAG CTA GG-3’；LoxP Reverse：5’-AAC ATG CCA TGC TCT TTG GTA GA-3’。引物设计遵循原则：为能成功检测2个LoxP位点，选择Middle piece序列5’端和3’端23bp和20bp的碱基，分别设计为Reverse和Forward primer。

结 果

一、S-Sox5条件性基因敲除打靶载体同源臂的设计

根据以前研究的成果，小鼠S-Sox5基因共有8个外显子，从第2个外显子开始翻译，第1个外显子不存在于L-Sox5中，因而缺失该外显子不应对L-Sox5有明显影响，故设计基因敲除的区域为S-Sox5的第1外显子［15］。如果同源重组成功，基因组上这段序列前后会置入LoxP位点，通过与组织细胞特异性Cre转基因小鼠杂交即能达到条件性敲除的目的。设计打靶载体的5’同源臂长约4.8kb，3’同源臂长约2.5kb，如图1所示。

图1 S-Sox5条件基因敲除打靶载体示意图

二、PCR扩增同源臂片段

如图2所示，用0.7%琼脂糖电泳PCR产物，电泳显示PCR产物扩增片段分别为4.8kb（upper arm）、2.5kb（down arm）和780bp （middle piece），与预期片段大小一致。

图2 同源臂PCR产物电泳检测结果

三、 DNDF7和LPL4 vector图谱

DNDF7和LPL4载体的图谱如图3所示。其中DNDF7载体同时含有DTa和NEO两个筛选抗性的标记（markers）；LPL4载体已连有2个LoxP位点， middle piece/pc2.1质粒选择BamHI和SalI双酶切后，与LPL4载体连接，再用KpnI和NotI双酶切形成LoxP-middle piece/LPL4-LoxP重组质粒，该质粒通过KpnI和NotI双酶切连接到DNDF7载体。

四、Middle-piece和down-arm片段经二轮重组，构建LoxP-middle piece-LoxP/down arm/DNDF7重组质粒

Middle-piece首先与携带2个LoxP位点的LPL4连接，经BamHI+SalI双酶切，电泳结果显示3054bp和780bp共2条DNA片段（图4A）；down-arm与DNDF7载体连接，经KpnI+AvrII双酶切，电泳结果显示6700bp和2500bp共2条DNA片段（图4B）。将middlepiece/LPL4和down-arm/DNDF7重组质粒经KpnI+NotI酶切后连接，双酶切鉴定电泳结果显示携带2个LoxP位点后的middle-piece大小约为1000bp，down-arm/ DNDF7大小为9200bp（图4C）。

图4 两轮重组后的阳性克隆酶切鉴定A: 用BamI/SalI对LoxP-中间臂-LPL4-LoxP质粒进进行酶切鉴定，获得3054bp和780bp共2条DNA片段。1～2为2个阳性克隆；B: 用KpnI/AvrII对下游同源臂-DNDF7质粒进行酶切鉴定，获得6700bp和2500bp共2条DNA片段。1～6为6个阳性克隆；C: 用KpnI/ NotI对LoxP-中间臂-LPL4-LoxP质粒和下游同源臂-DNDF7质粒的重组质粒进行酶切鉴定，获得9200bp和1000bp共2条DNA片段。1～5为5个阳性克隆

五、构建的S-Sox5条件基因打靶载体测序正确

参照本文“材料与方法”中S-Sox5条件基因打靶载体的构建与鉴定，获得S-Sox5条件基因打靶载体S-Sox5KO。酶切鉴定结果如图5所示：经BglII/XhoI酶切后得到4.8kb、10.2kb两个片段；经KpnI+NotI酶切后得到10.4kb、3.6kb、1.0kb三个片段，原因为：upper arm 片段5’ →3’端2.8 kb处亦有1个KpnI酶切位点，结合DNDF7图谱可见，从BglII→NotI共约1.6kb（1627bp），而KpnI同时酶切下upper arm的下游2.0kb片段，最终形成一个约3.6kb的片段。经KpnI/ AvrII酶切后得到7.9kb、4.6kb、2.5kb三个片段，原因为：upper arm 片段5’ →3’端2.8 kb处亦有1个KpnI酶切位点，在DNDF7图谱上可见，从BglII→KpnI共约1.6kb（1639bp），在KpnI和NotI之间已插入约1.0kb的LoxP-middle piece-LoxP片段，再加上KpnI同时酶切下upper arm的下游2.0kb片段，最终形成4.6kb片段。经AvrII/NotI酶切后得到11.5kb、3.5kb两个片段。上述结果与实验预期相符。用设计的一对LoxP特异性引物进行测序鉴定，结果显示2个LoxP位点已成功插入构建的载体中（图6）。

图5 S-Sox5 KO 质粒 酶切鉴定1～4孔分别为用BglI/XhoI，KpnI/NotI，KpnI/AvrII和 AvrII/NotI进行双酶切获得的片段

讨 论

最近研究发现S-Sox5主要存在于睾丸组织中，同时存在于其他含有运动纤毛的上皮组织如脑室管膜上皮组织、肺支气管上皮组织、睾丸附睾管上皮组织中，甚至少量表达于脾脏组织中［4］，推测其不仅引起运动纤毛功能障碍，也可能与免疫系统功能相关。为进一步研究S-Sox5在不同组织/细胞中的功能，有必要构建S-Sox5基因敲除靶向载体，探讨在S-Sox5转录因子缺失时，是否会引起小鼠表型及相关系统功能异常。

基因重组工程为研究基因在组织或细胞中的功能提供了极大的便利。条件敲除通过染色体特异性重组酶系统Cre-LoxP和FLP-frt来实现，在待敲除的一段目标DNA序列的两端各放置一个LoxP（或Frt）序列，构建条件基因打靶载体选择标记盒，得到flox（Flanked by loxP）小鼠。将fi ox小鼠与带有细胞特异性表达的Cre（或Flp）的小鼠交配繁殖，以获得在特定细胞里把目标基因敲除掉的小鼠，即条件性基因敲除小鼠［16］。与传统的全身敲除技术相比，条件性基因敲除小鼠可以使靶基因的表达或缺失发生在小鼠发育的某一阶段或某一特定的组织器官，从而使对小鼠基因组的修饰的范围和时间处于一种可控状态。

随着基因打靶小鼠模型的广泛应用，如何快速、有效地构建基因打靶载体越来越引起人们的重视。李大力教授实验室选择改良后的Red重组系统，利用50bp的同源重组序列直接从BAC载体中克隆出长片段的小鼠基因组序列，整个实验过程不涉及大片段的酶切连接反应［9］。通过同时共转染一条单链DNA寡核苷酸和一条双链选择标记盒到BAC的两个位点，Warming教授将传统基因打靶技术简化为两步反应：单循环的BAC修饰和修复过程［17］。本实验室所用的基因敲除打靶载体构建，是在传统的PCR扩增、酶切和连接等技术构建法基础上，利用新型DNDF7载体和已携带LoxP位点的LPL4载体，将目的基因的上、中、下游同源臂依次分段插入，虽然涉及大片段的酶切连接反应，但已有利用此两种新型载体构建Spag6条件基因敲除载体的成功经验，实验方法成熟，成功率高。利用含LoxP位点的LPL4载体，只需通过酶切把携带LoxP位点的目的片段及其上、下游同源臂加载在DNDF7载体上，即可实现对受体靶分子的目的改造，整个实验过程不需要再单独完成插入LoxP位点的步骤，大大缩短了构建载体的时间。重组酶Cre（Cyclization Recombination Enzyme），是一种来源于噬菌体P1的酶蛋白，可以催化LoxP位点间的DNA进行位点特异性重组。LoxP是重组酶Cre的识别位点，王雪敏教授所在实验室曾选择在PPARγ DNA的第1、2个外显子的两侧分别插入一个LoxP 序列的转基因纯合子小鼠，当重组酶Cre表达后，可以特异性的识别PPARγ两侧的这两个LoxP序列，并切断DNA双链，使得PPARγ第1、2个外显子缺失，达到影响PPARγ表达效果的作用［18］。本文构建S-Sox5条件基因敲除载体时，同样在S-Sox5两侧加入两个LoxP序列，使得S-Sox5的第1外显子缺失，达到影响S-Sox5表达的效果。随后对构建的最终载体仅需设计针对性的引物进行测序鉴定，确认2个LoxP位点的存在及序列正确，证实所构建的基因打靶载体序列准确，无突变发生。

基因敲除研究现在已发展出很多新的基因编辑技术，如RNAi、类转录激活因子效应物核酸酶（TALEN）和集群规律间隔的短回文重复序列/Cas9蛋白（CRISPR/Cas9）等［19，20］。这些技术与同源重组技术比较，可减少后期阳性细胞筛选工作，促进敲除动物的制备，在基因敲除斑马鱼、小鼠等研究中有了很大的进展［21，22］，但可能的 “off target”效应极大影响该技术的广泛应用 。本文使用的LPL4质粒作为一种功能载体已连接好LoxP位点，并在Ching-kang Chen教授实验室被广泛成功使用于基因打靶载体构建，获得了良好效果。因此为简化实验步骤提供了便利条件，利于在其他实验室开展。

打靶载体成功构建后，后续将完成ES细胞的筛选，根据Ching-kang Chen教授实验室的经验，DNDF7载体可使ES细胞阳性克隆率达到20%～30%［23］。原因是DNDF7质粒作为一种新型载体，同时含有DTa和NEO两种细胞筛选抗性的markers，大大增加了ES细胞筛选的阳性率，从而提高实验效率。ES细胞完成后，将产生LoxP fi oxed小鼠（即在目的基因两端拥有附加LoxP序列的小鼠），与Cre转基因小鼠杂交，产生特定的条件突变小鼠。该过程将耗时1～1.5年，获得目的小鼠后方可进行后续功能实验。本实验制备的S-Sox5 KO载体仅仅用于体内条件敲除小鼠的制备，无法用于体外功能试验。

已知，基因打靶效率的高低往往与打靶载体中所用基因组同源区的长短有关，同源区越长所介导的基因打靶效率就会越高。然而，用PCR扩增来获得基因同源区，同源区越长就越难得到PCR产物，同样PCR产物越大产生突变的概率越高［24］。本实验亚克隆的基因组DNA全长约8kb，其中包括约4.8kb的长臂同源区和2.5kb的短臂同源区。鉴于上游同源臂片段较长，大小接近5kb，在选择长链PCR专用试剂及特定条件获得PCR产物后，通过反复摸索实验条件，我们选择构建upper-arm/DNDF7和LoxP-middle piece-LoxP/ down-arm/DNDF7两种重组质粒，进而经AvrII+NotI双酶切获得最终S-Sox5 KO。为进一步构建基因敲除小鼠，研究相关基因的生物学功能奠定了基础。

1 Reiprich S， Kriesch J， Schreiner S， et al. Activation of Krox20 gene expression by Sox10 in myelinating Schwann cells. J Neurochem 2010； 112（3）: 744-754

2 Hernandez-Hernandez JM， Delgado-Olguin P，Aguillon-Huerta V， et al. Sox9 represses alpha-sarcoglycan gene expression in early myogenic differentiation. J Mol Biol 2009； 394（1）: 1-14

3 Donner AL， Episkopou V， Maas RL. Sox2 and Pou2f1 interact to control lens and olfactory placode development. Dev Biol 2007； 303（2）: 784-799

4 Kormish JD， Sinner D， and Zorn AM， Interactions between SOX factors and Wnt/beta-catenin signaling in development and disease. Dev Dyn 2010； 239（1）: 56-68

5 Chew LJ， Gallo V. The Yin and Yang of Sox proteins:Activation and repression in development and disease. J Neurosci Res 2009； 87（15）: 3277-3287

6 Lefebvre V.The SoxD transcription factors-Sox5， Sox6，and Sox13-are key cell fate modulators. Int J Biochem Cell Biol 2010； 42（3）: 429-432

7 Denny P， Swift S， Connor F， et al. An SRY-related gene expressed during spermatogenesis in the mouse encodes a sequence-specifi c DNA-binding protein. EMBO J 1992；11（10）: 3705-3712

8 Hiraoka Y， Ogawa M， Sakai Y， et al. The mouse Sox5 gene encodes a protein containing the leucine zipper and the Q box. Biochim Biophys Acta 1998； 1399（1）: 40-46

9 姜丽， 叶湘漓， 李大力. 利用Red重组系统快速构建基因打靶载体. 中国生物工程杂志 2011； 31（10）: 88-94

10 Wang D， Han S， Wang X， et al. SOX5 promotes epithelialmesenchymal transition and cell invasion via regulation of Twist1 in hepatocellular carcinoma. Med Oncol 2015；32（2）: 461

11 Blaise R， Grober J， Rouet P， et al. Testis expression of hormone-sensitive lipase is conferred by a specific promoter that contains four regions binding testicular nuclear proteins. J Biol Chem 1999； 274（14）: 9327-9334

12 Budde LM， Wu C， Tilman C， et al. Regulation of IkappaBbeta expression in testis. Mol Biol Cell 2002；13（12）: 4179-4194

13 Xu W， Zhang S， Qiu W， et al. Spermatogenesis-related ring fi nger gene ZNF230 promoter: identifi cation and functional analysis. Mol Biol Rep 2009； 36（5）: 1187-1193

14 Wunderle VM， Critcher R， Ashworth A， et al. Cloning and characterization of SOX5， a new member of the human SOX gene family. Genomics 1996； 36（2）: 354-358

15 Kiselak EA， Shen X， Song J， et al. Transcriptional regulation of an axonemal central apparatus gene， spermassociated antigen 6， by a SRY- related high mobility group transcription factor， S-SOX5. J Biol Chem 2010；285（40）: 30496-30505

16 Bouvier J， Cheng JG. Recombineering-based procedure for creating Cre/loxP conditional knockouts in the mouse. Curr Protoc Mol Biol 2009； Chapter 23:Unit 23.13

17 Newman RJ， Roose-Girma M， Warming S. Efficient conditional knockout targeting vector construction using co-selection BAC recombineering （CoSBR）. Nucleic Acids Res 2015； 43（19）: e124

18 吴巧琪， 章红妍， 王震，等. 神经干细胞特异性PPARγ基因敲除小鼠模型的制备与鉴定. 南方医科大学学报2014； 34（12）: 1768-1771

19 Korge S， Grudziecki A， Kramer A. Highly efficient genome editing via CRISPR/Cas9 to create clock gene knockout cells. J Biol Rhythms 2015； 30（5）: 389-395

20 Hendriks WT， Jiang X， Daheron L， et al. TALEN- and CRISPR/Cas9-mediated gene editing in human pluripotent stem cells using lipid-based transfection. Curr Protoc Stem Cell Biol 2015； 34: 5B.3.1-5B.3.25

21 Qin W， Liang F， Feng Y， et al. Expansion of CRISPR/ Cas9 genome targeting sites in zebrafish by Csy4-based RNA processing. Cell Res 2015； 25（9）: 1074-1077

22 Miura H， Gurumurthy CB， Sato T， et al. CRISPR/Cas9-based generation of knockdown mice by intronic insertion of artificial microRNA using longer single-stranded DNA. Sci Rep 2015； 5: 12799

23 Shim H， Wang CT， Chen YL， et al. Defective retinal depolarizing bipolar cells in regulators of G protein signaling （RGS） 7 and 11 double null mice. J Biol Chem 2012； 287 （18）: 14873-14879

24 王俊平， 张友明. Red/ET重组在基因打靶载体快速构建中的应用. 遗传 2005； 27（6）: 953-958

（2015-06-02收稿）

Construction of a knockout vector targeting S-Sox5 gene using DNDF7 vector and a novel LPL4 plasmid carrying two LoxP sites*

Liu Junpin1， Wang Zhiqiong2， Ping Guanglun1， Shi Yuqin1， Zhang Ling1**， Zhang Zhibing1，3**
1. School of Public Health， Wuhan University of Science and Technology， Wuhan， 430065； 2. Department of Hematology，Tongji Medical College of Huazhong University of Science & Technology； 3. Department of Obstetrics & Gynecology，Virginia Commonwealth University， Richmond， VA， USA. 23298

Zhang Ling， E-mail: zhangling7015@126.com； Zhang Zhibing， E-mail: zhangzhibing@ hotmail.com

Objective It has been shown that S-SOX5 transcriptionally regulates sperm associated antigen 6 （Spag6），a gene essential for ciliary function. The aim of this study is to construct a knockout vector targeting S-Sox5 gene to investigate its function in vivo. Methods The DNDF7 vector and the LPL4 vector carrying two LoxP sites were used to generate the S-Sox5 targeting vector. Briefi y， exon 1 of S-Sox5 was selected as the targeting region （middle piece）， and DNA from ES cells （SV129 background） was used as a template to amplify upper arm and down arm fi anking the targeting region. The middle piece was cloned into LPL4 vector. Then， the middle piece， together with the two LoxP sites were released from the LPL4 vector and ligated to DNDF7 plasmid. The upper arm and down arm were also cloned into DNDF7 vector subsequently to create the fi nal construct targeting exon 1 of S-Sox5. Results The S-Sox5 KO vector was confi rmed by series digestion with restriction enzymes and DNA sequencing. Conclusion Successfully constructing the S-Sox5 KO vector provides a tool to make a fi oxed S-Sox5 mice model and study the role of S-Sox5 in specifi c cells/tissues in vivo.

S-Sox5 gene； gene-targeting vector； DNDF7 vector； LPL4 vector

10.3969/j.issn.1008-0848.2015.09.002

R 349

资助: 国家自然基金青年基金项目（81300536，81571428，81502792）；

湖北省卫生厅项目青年基金（WJ2015Q026， QJX2012-22）

**共同通讯作者: 张玲， E-mail: zhangling7015@126.com； 张志兵， E-mail: zhangzhibing@ hotmail.com