鸡骨草总黄酮的超声波提取工艺及抗氧化活性研究

黄敏 廖春燕

摘要：为探讨鸡骨草总黄酮的超声波提取条件及清除自由基的能力，采用单因素试验和正交试验优化鸡骨草总黄酮的超声波提取工艺，分别采用水杨酸、邻苯三酚自氧化法测定鸡骨草总黄酮提取液对羟自由基、超氧离子自由基的清除作用。结果表明，鸡骨草总黄酮的超声波提取最优工艺是用25倍70%乙醇浸泡鸡骨草粉末，超声波提取4次，每次18 min，所得提取液总黄酮提取率为1.75%；鸡骨草提取液浓度越高，对羟自由基和超氧阴离子的清除作用越大。超声波提取法适用于鸡骨草总黄酮的提取，且提取液对羟自由基和超氧离子自由基具有一定的清除作用。

关键词：鸡骨草；总黄酮；超声波；自由基

中图分类号：S567.23+9；R284.2 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2015）14-3502-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.14.043

Study on the Ultrasonic Extraction Process and Antioxidant Activity of Total Flavonoids in Abrus cantoniensis L.

HUANG Min1， LIAO Chun-yan2

（1. Food Sciences & Biological Engineering Department ，Guangdong Industry Technical College， Guangzhou 510300，China；

2. Department of Biological and Chemical Engineering ，Guangxi University of Technology， Liuzhou 545006，Guangxi，China）

Abstract： The conditions of ultrasonic extraction of total flavonoids in Abrus cantoniensis L. and its ability of free radical scavenging were investigated. The optimized condition of extraction of total flavonoids was examined through single factor test and orthogonal design. The autoxidation of salicylic acid and pyrogallol was used to assay the abilities of the extract of clearing the free radical of ·OH and ·O2-. The most optimal extracting process was ultrasonic extraction four times with 25 times of 70% ethanol by 18 minutes each time.Under this condition， the amount of the total flavonoids of the extract was 1.75%. And the abilities of the extract of clearing ·OH and ·O2- enhances with the increase of concentration. it is indicated that the method of ultrasonic extraction could be used to determine the total flavonoids in Abrus cantoniensis L.. And the extract of Abrus cantoniensis L. could effectively clear the free radical of ·OH and ·O2-.

Key words： Abrus cantoniensis L.； total flavonoids； ultrasonic extraction； free radical

鸡骨草别名红母鸡草、石门坎、黄食草、细叶龙鳞草、大黄草，为豆科植物广州相思子（Abrus precatorius L.）的干燥全株，全草含相思子碱、胆碱、甾醇化合物、黄酮类、氨基酸、糖类等，具有清热解毒，舒肝止痛的功效[1]。

黄荣韶等[2]测定了鸡骨草中总黄酮的含量，证明鸡骨草中含有丰富的黄酮类成分。黄酮是一种很强的抗氧化剂，可有效清除体内的氧自由基。张丽丹等[3]利用超声波乙醇浸提法提取鸡骨草中的黄酮类物质，得到的提取液用来检测其清除羟自由基的能力，结果发现鸡骨草提取液对羟自由基有很好的清除作用；王晓波等[4]采用邻苯三酚自氧法测定鸡骨草对自由基和亚硝酸盐的清除作用，证明在试验浓度范围内对超氧阴离子自由基具有清除作用。广东省有丰富的鸡骨草资源，因此，合理开发广东省特产的中药材鸡骨草对鸡骨草制剂的投放市场具有深刻意义。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

鸡骨草（市售）；三（羟甲基）氨基甲烷（国药集团化学试剂有限公司）；芦丁（中国食品药品检定研究院）；水杨酸（天津市福晨化学试剂厂）；焦性没食子酸（天津市福晨化学试剂厂）；其他试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

7230G型可见光分光光度计（上海精密科学仪器有限公司）；T6型新世纪紫外光可见分光光度计（北京普析通用仪器有限责任公司）；AB204-N型电子分析天平（上海市梅特勒-托利亨仪器有限公司）；DMF-10A型500克摇摆式高速中药粉碎机（浙江温岭市铭大药材机械设备有限公司）；X-150型超声波细胞粉碎仪（南京先欧仪器制造有限公司）。

1.3 试验方法

1.3.1 标准曲线的制定 精确称取芦丁标准品10 mg，加 80%乙醇溶解，定容到50 mL容量瓶中摇匀，制成0.2 mg/mL的标准品溶液。分别取该溶液0.0、0.2、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0 mL于试管中，然后在试管中分别加80%的乙醇5.0、4.8、4.5、4.0、3.0、2.0、1.0 mL，再各加5%亚硝酸钠0.3 mL摇匀，放置6 min后加10% 硝酸铝0.3 mL摇匀，15 min后加入1 mol/L氢氧化钠4.0 mL和0.4 mL去离子水摇匀，放置10 min，在510 nm处测其吸光度。绘制标准曲线，得回归方程：y=12.655x+0.006 4，R2=0.999 8，表明芦丁在0.00～0.08 mg/mL有良好的线性关系。

1.3.2 单因素试验 参考文献[2]中的方法，将洗干净晒干的鸡骨草用粉碎机粉碎，过60目筛。称取鸡骨草粉碎2.000 g，加入石油醚（30～60 ℃）浸泡过夜，80 ℃水浴蒸除石油醚，再加50 mL乙醇超声波提取，用真空抽滤机抽滤，收集滤液，置80 ℃水浴蒸干，用60%乙醇溶解，定容至50 mL。吸取0.5 mL按照标准曲线的方法测定总黄酮含量。对照为吸取相同体积的样品液，除用0.3 mL 60%乙醇代替10%硝酸铝溶液外，其余测定方法与正常测定相同。以料液比（g∶mL，下同）、超声波时间、超声波次数、超声波频率、乙醇体积分数为考察对象，对总黄酮含量进行测定。

1.3.3 正交试验 以单因素试验中影响鸡骨草总黄酮提取率的4个主要因素（料液比、乙醇体积分数、超声波时间、超声波次数）作为考察因子，设计了4因素3水平的正交试验对总黄酮提取工艺进行考察，因素与水平见表1。

1.3.4 提取液抗氧化性能的测定

1）对羟自由基的清除作用。参照文献[5]中的方法，在25 mL具塞试管中加入2 mL 9 mmol/L FeSO4和2 mL 8.8 mmol/L H2O2，再加入5 mL不同浓度（0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4 mg/mL）的样品溶液，混匀后用9 mmol/L水杨酸-乙醇溶液定容至刻度。在（37±1） ℃恒温水浴中反应15 min后，在波长510 nm处测定其吸光度Ax，对照组除不加双氧水外，其他试剂的添加同上。

清除率=1-×100%

式中，A0为对照的吸光度，Ax为不同浓度样品溶液的吸光度。

2）对超氧离子自由基的清除作用。先将提取物用去离子水配置成浓度不同的梯度，在10 mL的比色管中分别加入4 mL 0.05 mol/L pH 8.2的Tris-HCl缓冲液，置于25 ℃水浴中预热20 min，然后加入不同浓度（0.016、0.032、0.048、0.064、0.080 mg/mL）样品液1 mL，再加入在25 ℃水浴中预热的0.2 mmol/L邻苯三酚溶液1 mL（邻苯三酚用0.05 mol/L的盐酸配制），混匀后在25 ℃水浴中反应4 min，立即用两滴浓盐酸终止反应，并在325 nm处测定吸光度（A样）。每管做3个重复，取平均值。

同上述过程，只是用1 mL去离子水代替样液，测定结果为原始管（A原）。每管做3个重复，取平均值。

清除率=×100%

式中，A原为用去离子水代替样液的吸光度，A样为样品溶液的吸光度。

2 结果与分析

2.1 料液比的考察

在乙醇体积分数为70%，超声波频率100 Hz，时间为15 min，超声波提取3次的条件下，调节料液比分别为1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60，测得总黄酮的提取率见图1。由图1可知，总黄酮的提取率随着料液比的降低先升高后降低，在1∶30处出现最高峰，故选择料液比为1∶30。

2.2 超声波时间的考察

在料液比为1∶30，乙醇体积分数为70%，超声波频率100 Hz，超声波处理3次的条件下，调节超声时间分别为5、10、15、20、25、30、35、40 min，测得总黄酮的提取率见图2。由图2可知，总黄酮的提取率随着超声波时间地增加而增加，在15 min处出现最高峰，之后逐渐下降，故选超声波时间为15 min。

2.3 超声波次数的考察

在料液比为1∶30，乙醇体积分数为70%，超声波频率100 Hz，时间为15 min的条件下，分次进行超声波处理，测得总黄酮的提取率见图3。由图3可知，总黄酮的提取率在提取3次处出现最高峰，故选择超声波提取次数为3。

2.4 乙醇体积分数的考察

在料液比为1∶30，超声波频率100 Hz，时间为15 min，处理3次的条件下，调节乙醇体积分数为40%、50%、60%、70%、80%，测得总黄酮的提取率见图4。由图4可知，总黄酮的提取率随着乙醇体积分数的增大先升高后降低，在70%处出现最高峰，故选择乙醇体积分数为70%。

2.5 超声波频率的考察

在料液比为1∶30，乙醇体积分数为70%，超声波时间为15 min，处理3次的条件下，调节超声波频率分别为50、100、150、200 Hz，测得总黄酮的提取率见图5。由图5可知，总黄酮的提取率随着超声波频率的加大呈现先上升后下降的趋势，但上升幅度不大，故在正交试验中不作为分析因素。

2.6 正交试验结果

根据单因素试验结果，乙醇体积分数、料液比、超声波时间、超声波次数对提取率的影响较大，故选择这4个因素作为正交试验的因素，正交试验结果见表2、表3。由表2和表3可知，对鸡骨草中总黄酮提取率的影响由大到小的顺序是料液比>超声时间>乙醇体积分数>超声次数，其中料液比对鸡骨草总黄酮提取率的影响具有统计学意义。从直观分析看出，最优水平为A1B1C1D1，在此水平下提取液中总黄酮提取率为1.74%；从k值分析看出，最优水平为A2B1C3D3。为得到最佳提取条件，对A2B1C3D3组合做正交验证试验，得到总黄酮提取率为1.75%，且重复性好。因此，确定鸡骨草总黄酮超声波提取工艺的最终优化方案为用25倍70%乙醇浸泡鸡骨草粉末，超声波提取4次，每次18 min。

2.7 鸡骨草提取液对羟自由基的清除作用

由图6可知，经此方法处理得到的鸡骨草提取液对羟自由基具有清除作用，且随着鸡骨草提取液浓度的增加，对羟自由基的清除作用就越强，提取液的浓度与清除率具有良好的量效关系，说明鸡骨草提取液中含有的总黄酮对羟自由基有一定的清除作用。

2.8 鸡骨草提取液对超氧离子自由基的清除作用

由图7可知，经此方法处理得到的鸡骨草提取液具有清除超氧离子自由基的作用，且随着鸡骨草提取液浓度的增加，对超氧离子自由基的清除作用就越强，提取液的浓度与清除率具有良好的量效关系，说明鸡骨草提取液中含有的总黄酮对超氧离子自由基有较好的清除作用。

3 小结

随着人们生活品质的提高，由黄酮衍生出来的黄酮类保健品、化妆品越来越多。本研究通过采用芦丁对照、超声波辅助溶剂提取鸡骨草总黄酮并测提取物中总黄酮含量，超声波提取工艺试验各因素影响由大到小的顺序为料液比>超声时间>乙醇体积分数>超声次数，经过对正交最优组合的重复试验，得出用25倍70%乙醇浸泡鸡骨草粉末，超声波提取4次，每次18 min，总黄酮的提取率为1.75%，且重复性良好。通过采用水杨酸和邻苯三酚自氧化法证明鸡骨草提取液对羟自由基和超氧离子自由基有一定的清除作用。

参考文献：

[1] 国家中医药管理局《中华本草》编委会.中华本草（四册）[M].上海：上海科学技术出版社，1999.

[2] 黄荣韶，玉永雄，胡 艳，等.鸡骨草总黄酮含量测定及其含量动态变化研究[J].中国中药杂志，2006，31（17）：1428-1431.

[3] 张丽丹，罗建华，蒙春越，等.鸡骨草总黄酮提取及对羟自由基清除作用[J].微量元素与健康研究，2007，24（2）：44-45.

[4] 王晓波，黄叠玲，刘冬英，等.鸡骨草总黄酮清除自由基及抑制亚硝化作用研究[J].时珍国医国药，2012，23（4）：942-944.

[5] 廖春燕，杨欣绿.D101型大孔树脂纯化鸡骨草总黄酮的工艺优选[J].中国实验方剂学杂志，2013，19（2）：38-40.