复合酶法提取金针菇总黄酮的优化

王广慧 魏雅冬 于德涵

摘要：为了研究采用复合酶法从金针菇[Flammulina velutiper （Fr.） Sing]中提取总黄酮的最适条件，通过单因素试验和正交试验探讨了料液比、酶反应时间、酶反应温度、酶反应pH对金针菇总黄酮提取率的影响，并以金针菇总黄酮提取率为评价指标，优化提取工艺。结果表明，复合酶法提取金针菇总黄酮的最适条件为料液比1∶20（g∶mL），酶反应时间80 min，酶反应温度60 ℃，酶反应pH 5，在此条件下金针菇总黄酮的提取率为4.76%。

关键词：复合酶法；金针菇[Flammulina velutiper （Fr.） Sing]；总黄酮；提取

中图分类号：S646.1+5；R284.2 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2015）14-3482-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.14.038

Optimization of Complex Enzymatic Extraction of Flavone From

Flammulina velutiper （Fr.） Sing

WANG Guang-hui，WEI Ya-dong，YU De-han

（Department of Pharmacy Chenical Engineering， Suihua University， Suihua 152061， Heilongjiang， China）

Abstract： In this paper， the optimal conditions of complex enzymatic extraction of flavone from Flammulina velutiper （Fr.） Sing were studied. Through the single factor and orthogonal experiments， the influences of solid-liquid ratio， enzymatic reaction time， enzymatic reaction temperature and enzymatic reaction pH on the extraction rate of flavone were discussed， and the extraction process was optimized. The experimental results showed that the optimum conditions were as follows： the solid-liquid ratio of 1：20（g/mL）， enzymatic reaction time of 80 min， enzymatic reaction temperature of 60 ℃ ， enzymatic reaction pH of 5. Under this condition， flavone extraction rate was 4.76%.

Key words： complex enzyme； Flammulina velutiper （Fr.） Sing； total flavone； extraction

金针菇[Flammulina velutiper （Fr.） Sing]学名毛柄金钱菌，属担子菌纲伞菌目白蘑科金钱菌属。现代药理研究表明，金针菇含有多种有效药用成分，尤其是黄酮类化合物具有消炎、抗氧化、抗肿瘤、降血压、保护心脑血管系统等多种生物活性[1-5]。因此，金针菇总黄酮具有广阔的开发前景，建立高效经济的金针菇总黄酮提取方法具有重要的现实意义。本研究采用复合酶法提取金针菇总黄酮，并通过单因素试验和正交试验对金针菇总黄酮的提取工艺进行了优化，以期为合理开发金针菇总黄酮资源开辟一条新的途径。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

金针菇，绥化学院食用菌研究所提供；无水乙醇、亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠、磷酸氢二钠、柠檬酸等均为国产分析纯试剂。木瓜蛋白酶（10 000 U/g）和纤维素蛋白酶（10 000 U/g）购于上海信帆生物科技有限公司。

1.2 主要仪器

DK-98-ⅡA型电热恒温水浴锅、FW100型高速万能粉碎机：天津市泰斯特仪器有限公司；TDL-60B-B型台式低速离心机：湖南星科科学仪器有限公司；752型紫外可见分光光度计：上海菁华科技仪器有限公司；JY501型电子分析天平：上海衡平仪器仪表厂。

1.3 试验方法

1.3.1 标准曲线的绘制 精确称取在105 ℃下常压干燥至恒重的芦丁标准品 5.0 mg，添加 70%乙醇定容至50 mL摇匀，得芦丁标准溶液（0.10 mg/mL）。准确吸取芦丁标准溶液0.00、0.50、1.00、2.00、3.00、4.00、5.00 mL于10.00 mL容量瓶中，分别加入 5%亚硝酸钠溶液 0.30 mL摇匀，静置6 min；再加入10%硝酸铝溶液0.30 mL摇匀，静置6 min；再加入4%氢氧化钠溶液4.00 mL，用70%乙醇稀释至刻度摇匀，静置10～15 min，以不加芦丁为空白对照，于 510 nm 处测吸光度。以芦丁浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。

1.3.2 金针菇中总黄酮的测定方法 将所测得的金针菇总黄酮提取液的吸光度（测定方法同“1.3.1”）代入标准曲线方程可计算出总黄酮浓度C（mg/mL），则可计算总黄酮提取率为：

总黄酮提取率=C×上清液体积×稀释倍数/原料质量×100%

1.3.3 复合酶法提取金针菇总黄酮的方法 金针菇经除杂、50 ℃烘箱干燥以及利用高速万能粉碎机粉碎（粉碎后过80目筛）等预处理后，得到金针菇子实体干粉。准确称取金针菇粉若干份，每份3.0 g，放入烧杯中按一定比例加入磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液及样品量1.5%的复合酶（木瓜蛋白酶和纤维素酶按质量比1∶1混合），酶解一段时间后80 ℃灭酶10 min。提取后离心，取上清液。将上清液用70 ℃水浴适当浓缩后与95%乙醇按1∶3混合，置于4 ℃下醇沉12 h， 以除去多糖等杂质。然后3 500 r/min离心10 min。准确吸取上清液1 mL于10.00 mL 容量瓶中，后面的测定方法如“1.3.2”所述，计算出提取液中的总黄酮浓度及总黄酮提取率。

1.3.4 单因素试验

1）料液比。准确称取金针菇粉5份，每份3.0 g。将每份金针菇粉中再加入样品量1.5%的复合酶，酶解温度50 ℃，酶解pH 5，反应时间80 min，分别设置料液比为1∶20、1∶25、1∶30、1∶35、1∶40（g∶mL，下同）的条件下提取总黄酮，测定总黄酮提取率。

2）酶反应时间。将每份金针菇粉按最佳料液比加缓冲液， 添加酶量为样品量的1.5%，在酶解温度50 ℃，酶解pH 5的条件下，调节酶反应时间，分别在50、60、70、80、90 min时提取总黄酮，测定总黄酮提取率。

3）酶反应温度。将每份金针菇粉按最佳料液比加缓冲液，按样品量的1.5%加入复合酶，在最适酶解时间，酶解pH 5的条件下，调节复合酶反应温度，分别在30、40、50、60、70 ℃时提取总黄酮，测定总黄酮提取率。

4）酶反应pH。将每份金针菇粉按最佳料液比加缓冲液，按样品量的1.5%加入复合酶，在最适酶解温度、最适酶解时间的条件下，调节酶反应pH，分别在pH 为3、4、5、6、7时提取总黄酮，测定总黄酮提取率。

1.3.5 正交试验 在单因素试验的基础上选择对金针菇总黄酮提取率影响较大的因素和水平进行正交试验，以确定提取金针菇总黄酮的最佳条件。

1.3.6 不同方法的对比研究

1）乙醇浸提法。乙醇浸提法参照文献[6]。

2）超声波辅助乙醇浸提法。对金针菇按照“1.3.3”的方法进行预处理，得到子实体干粉。准确称取金针菇粉3.0 g，放入烧杯中，按料液比1∶25加入70%乙醇，浸泡30 min后在功率为400 W下超声波处理6 min，离心取上清液。准确吸取上清液1 mL于10.00 mL 容量瓶中，测吸光度，计算出提取液中总黄酮浓度及提取率。

2 结果与分析

2.1 标准曲线的绘制

根据试验获得的数据绘制的标准曲线见图1，得到总黄酮的线性回归方程为：y=0.375 9x+0.019 6，R2=0.997 9。

2.2 单因素试验结果

2.2.1 料液比 试验设置了5个不同的料液比，分别是1∶20、1∶25、1∶30、1∶35、1∶40，结果见图2。由图2可知，料液比为1∶20时金针菇总黄酮的提取率为4.46%，高于其他的提取率，因而最佳料液比为1∶20。

2.2.2 酶反应时间 将每份金针菇粉按最佳料液比1∶20，在酶解温度50 ℃，酶解pH 5的条件下，调节复合酶反应时间，分别在50、60、70、80、90 min时提取总黄酮，结果见图3。由图3可知，酶反应时间80 min时金针菇总黄酮的提取率为4.46%高于其他水平下的提取率，因而最佳酶反应时间为80 min。

2.2.3 酶反应温度 将每份金针菇粉按最佳料液比1∶20，酶反应时间80 min，酶反应pH 5的条件下，调节复合酶反应温度，分别在30、40、50、60、70 ℃时提取总黄酮，得到的结果见图4。由图4可知，酶反应温度为50 ℃时金针菇总黄酮的提取率4.46%高于其他水平下的提取率，因而最佳酶反应温度为50 ℃。

2.2.4 酶反应pH 将每份金针菇粉按最佳料液比1∶20，酶反应时间80 min，酶反应温度50 ℃，调节酶反应pH，分别在3、4、5、6、7时提取总黄酮，结果见图5。由图5可知，酶反应pH 5时金针菇总黄酮的提取率4.46%，高于其他水平下的提取率，因而最佳酶反应pH为5。

2.3 正交试验结果

在单因素试验的基础上选择对金针菇总黄酮提取率影响较大的因素和水平进行L9（34）正交试验，以金针菇总黄酮提取率作为评价指标，因素与水平见表1，正交试验结果见表6。由表2可知，各因素对提取率的影响依次为料液比>酶反应温度>酶反应pH>酶反应时间。由此确定复合酶法提取金针菇总黄酮的最优条件为A1B2C3D2，即料液比1∶20、酶反应温度60 ℃、酶反应pH 5、酶反应时间80 min。在此条件下做验证试验，得到金针菇总黄酮提取率为4.76%。

2.4 不同方法的对比研究

用设计中的3种方法提取金针菇总黄酮并测定金针菇总黄酮的提取率，试验结果见图6。由图6可知采用复合酶法所获得的金针菇总黄酮提取率最高。

3 小结

本研究利用复合酶法提取金针菇总黄酮，并通过单因素试验和正交试验对金针菇总黄酮的提取工艺进行了优化。金针菇细胞内成分复杂，除总黄酮外还含有其他的生物大分子物质，如蛋白质和纤维素等。这些物质的存在无疑会影响到总黄酮的释放。由于酶促反应具有专一性、高效性、反应条件温和等优点，在试验中加入由纤维素酶和木瓜蛋白酶组成的复合酶体系，两种酶的共同作用能够有效降解细胞中蛋白质、纤维素等杂质，使黄酮类物质更容易从细胞中释放，从而提高了提取率[7]。同超声波辅助法相比，复合酶法既减少了对提取物结构和性质的破坏，又由于在提取过程中溶剂用量很少，从而为后续的精制过程创造了有利条件。复合酶法提取金针菇总黄酮的最佳工艺条件为料液比1∶20，酶反应时间80 min，酶反应温度60 ℃，酶反应pH 5，在此条件下，金针菇总黄酮的提取率为4.76%。

参考文献：

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