沙枣植物基因组DNA提取方法的比较

马昕璐　黄俊华

摘 要：为深入研究沙枣的药用价值，对比沙枣植物基因组DNA提取的方法，选取SDS法、CTAB法、酚—氯仿法以及试剂盒法4种提取方法，通过琼脂糖凝胶电泳对所提取DNA进行完整性检测，通过紫外分光光度法对DNA进行纯度、浓度检测。 结果显示，试剂盒法提取DNA的A260/A280值嫩叶为1.83，标本叶为1.81，A260/A230值嫩叶为2.31，标本叶为2.26。 研究认为，从纯度与完整度观察分析，试剂盒法为最优方法，经济有效，可在CTAB方法上进行改进。

关键词：沙枣；DNA提取方法；比较

中图分类号：S665.1 文献标识码：A DOI 编码：10.3969/j.issn.1006-6500.2015.09.001

Comparison on Extraction Methods of Genomic DNA of Elaeagnus angustifolia L.

MA Xin-lu，HUANG Jun-hua

（Xinjiang Agricultural University， Urumqi，Xinjiang 830000，China）

Abstract： In order to compare methods of extraction genomic DNA from Elaeagnus angustifolia L. ， four extraction methods including SDS method， CTAB method， phenol-chloroform method and kit method were selected， and extracted DNA were detected by agarose gel electrophoresis， DNA purity were detected using ultraviolet spectrophotometer. The result showed that the A260/A280 numerical value for young leaves was 1.83， speciens leaves was 1.81， the A260/A230 numerical value for young leaves was 2.31， speciens leaves was 2.26. The kit method was the optimal method， in term of economic and effective， and could be modified in the CTAB method.

Key words： Elaeagnus angustifolia L； DNA extraction method； comparison

沙枣（Elaeagnus angustifolia L. ）为胡颓子科胡颓子属的落叶小乔木，又名桂香柳、七里香等，生长在干旱、半干旱、荒漠、半荒漠地区，被称为沙漠里的“宝树”。在西北地区是重要的防护林树种，分布广泛，沙枣含多种功能保健成分，其药用价值已成为近年来研究的重点。

据《新疆药用植物志》记载，沙枣具有“强壮、镇静、健胃、止泻、利尿”的功效[1-3]。沙枣果实、树皮和花均能入药[4]，在维吾尔医学中，沙枣果实浸出物的浓缩液是民间治疗作呕胃胀的药方[5]。沙枣茎枝产生的胶汁俗称“沙枣胶”，可加入消炎、活血、定痛复方中，外用可治疗骨折。沙枣叶总提取物对慢性气管炎、菌痢、冠心病、心律失常有治疗作用，对烧伤创面也有一定疗效。孙建新[6]发现沙枣提取物对人胃癌、肝癌、胰岛癌细胞株具有直接杀伤作用，能抑制肿瘤细胞增殖。Ahmadiani[7]研究发现沙枣果实水提物具有显著的抗炎效果。陶大勇[8]研究发现沙枣提取物可抑制大肠杆菌的生长繁殖。多里坤·木扎帕尔[9]研究发现沙枣干粉能够对婴幼儿的腹泻起一定减缓作用，减少大便数量，促进盐分的摄入。而皮肤病学研究验证沙枣花浸膏以及沙枣果实的可食部分提取物能够促使伤口快速愈合[10]。

沙枣具有较好的药理活性和保健功能，不同环境地区的沙枣以及沙枣种下不同的等级类型具有不同的药用价值，目前对于沙枣各地区的种间差异及种下等级的分类虽然也有较多研究，但种的变异较大，不易区分。所以非常有必要借助分子这一手段，使沙枣种间及种下等级分类更为清晰，更深入研究沙枣的药用价值，为沙枣的开发提供相应的理论基础。而分子研究的基础物质是DNA，其提取技术成为分子生物学的最基本技术[11]。从植物组织中提取DNA要求简便、有效、快捷、经济。但由于沙枣植物组织中含有较多的多糖和其他次生代谢产物（如酚、酯、萜、色素等），这便给高质量的DNA提取带来了较多的困难[12]，所以选择更好的植物基因组DNA提取方法是十分有必要的。

1 材料和方法

1.1 材料预处理

试验叶片于2012年8月，采自新疆乌鲁木齐市乌拉泊地区沙枣植物叶片，一株制作成标本，放入标本夹；一株用蒸馏水洗去尘土，晒干，放入-60 ℃冰箱冷冻备用。

1.2 几种重要溶液的配制

（1）1 mol·L-1 Tris-HCl 溶液（pH值8.0）。根据其相对分子质量，将12.11 g 的Tris碱溶于80 mL超纯水，冷却至室温，用浓盐酸调定pH值至8.0，然后定容至100 mL，分装后高压灭菌，室温保存备用。

（2）0.5 mol·L-1 EDTA 溶液 （pH值8.0）。根据其相对分子质量，将18.61 g的 EDTA-Na2·H2O溶于80 mL超纯水，然后用固体NaOH调节溶液pH值至8.0，用水定容至100 mL，分装后高压灭菌，室温保存备用。

（3） TE缓冲液（pH值8.0）。根据相对分子质量进行计算，将1 mol·L-1 Tris-HCl（pH值8.0）2.0 mL、0.5 mol·L-1 EDTA（pH值8.0）0.4 mL、超纯水197.6 mL依次放入试管混合均匀，然后调溶液pH值至8.0，分装后高压灭菌，4 ℃保存备用（100 mL）。

（4）5×TBE（Tris-硼酸）电泳缓冲液。将27 g 的Tris碱，13.75 g的硼酸，加入10 mL 的0.5 mol·L-1 EDTA（pH值8.0），350 mL的蒸馏水，搅拌溶解后，定容至500 mL。由于琼脂糖凝胶电泳时使用液为0.5×TBE，则需要取配制的5×TBE 500 mL加水定容至5 L即可使用。

（5）SDS提取缓冲液。将1 mol·L-1Tris-HCl（pH值8.0）10 mL、0.5 mol·L-1EDTA（pH值8.0）10 mL、5 mol·L-1NaCl 10 mL、10%SDS 20 mL、100%β-巯基乙醇2 mL、超纯水26 mL混匀备用。

1.3 DNA提取方法及步骤

1.3.1 SDS法提取DNA （1）取1.5 mL Eppendorf管，加入600 μL SDS提取缓冲液，1 mL10%SDS溶液，混匀，置于65 ℃水中待用。

（2）取2 g的植物幼嫩叶片或标本叶，70%乙醇清洗，双蒸水冲洗干净后，置于研钵中，加入液氮，轻轻捣碎叶片，待液氮将要挥发完，快速研磨至其完全成为粉状，把粉末转移到有标记的1.5 mL无菌Eppendorf管中。

（3）将冻粉加入备用述Eppendorf管中，混匀，65 ℃水浴30 min，每10 min上下翻转，使反应体系尽量均匀。

（4）向Eppendorf管中加入200 μL 5 mol·L-1 KAc，混匀，置水浴中30 min。

（5）将样品管置离心机于4 ℃下12 000 r·min-1离心10 min，离心后将上清液小心转移到另一个新Eppendorf管中。

（6）加入等体积的氯仿/异戊醇，盖好管盖后上下颠倒离心管使溶液混匀，再置于离心机12 000 r·min-1离心10 min。

（7）取上清液，加入等体积的异丙醇，盖好管盖后上下颠倒离心管使溶液混匀，然后静置至试管中出现絮状物。

（8）挑出絮状物置新Eppendorf管中，加入600 μL 的70%乙醇洗涤沉淀，将沉淀振荡起数秒钟后，12 000 r·min-1离心10 min，去上清液。再重复上述步骤，洗涤沉淀1次。

（9）室温下放置30 min，使沉淀干燥，加入50 μL TE溶解，置于37 ℃水浴消化30 min，备用。

1.3.2 CTAB法提取DNA （1）取2 g的植物幼嫩叶片或标本叶，70%乙醇清洗，双蒸水冲洗干净后，置于研钵中，加入液氮，轻轻捣碎叶片，待液氮将要挥发完，快速研磨至其完全成为粉状，把粉末转移到有标记的1.5 mL无菌Eppendorf管中。

（2）加入650 μL预热的CTAB提取缓冲液，用力振荡1～2 min，马上放入65 ℃水浴锅中，水浴90 min。其间，每隔15 min用手轻微振荡3或4次。

（3）从水浴锅中取出Eppendorf管，自然冷却至室温，置于离心机，12 000 r·min-1离心10 min，取上清至新的Eppendorf管中。

（4）在取出的上清中加入等体积的苯酚/氯仿/异戊醇（25∶24∶1），盖好管盖后缓慢上下颠倒混匀后，置于离心机，12 000 r·min-1离心10 min。

（5）将上清液转移至另一Eppendorf管中，加入等体积氯仿/异戊醇（24∶1），盖好管盖后上下颠倒离心管使溶液混匀，再置于离心机12 000 r·min-1离心10 min。

（6）取上清液转移至另一Eppendorf管中，加入等体积预冷的异丙醇，轻轻上下摇动Eppendorf管，注意观察DNA将从溶液中析出。

（7）将加入异丙醇的Eppendorf管，-20 ℃放置10 min，取出置于离心机，12 000 r·min-1离心10 min。

（8）可看到白色DNA沉淀时取出，去上清，加入600 μL 的70%乙醇洗涤沉淀，将沉淀振荡起数秒钟后，12 000 r·min-1离心10 min，去上清液。再重复上述步骤，洗涤沉淀1次。

（9）室温下放置30 min，使沉淀干燥，加入50 μL TE溶解，置于37 ℃水浴消化30 min，备用。

1.3.3 酚—氯仿法提取DNA （1）取2 g的植物幼嫩叶片或标本叶，70%乙醇清洗，双蒸水冲洗干净后，置于研钵中，加入液氮，轻轻捣碎叶片，待液氮将要挥发完，快速研磨至其完全成为粉状，把粉末转移到有标记的1.5 mL无菌Eppendorf管中。

（2）加入650 μL预热的TEN9提取液，混匀，离心管置于65 ℃水浴锅中，水浴45 min。其间，每隔15 min用手轻微振荡3或4次。

（3）从水浴锅中取出Eppendorf管，自然冷却至室温，加入与管中的液体等体积的苯酚/氯仿/异戊醇（25∶24∶1），小心混匀，置于离心机，室温12 000 r·min-1离心10 min，抽提1次，取上清至新的Eppendorf管中。

（4）加入与上清液等体积的氯仿/异戊醇（24∶1），盖好管盖后缓慢上下颠倒混匀后，置于离心机，室温12 000 r·min-1离心10 min，再抽提1次。

（5）取上清液转移至另一Eppendorf管中，加入2倍体积预冷的异丙醇，置于离心机，12 000 r·min-1离心10 min。将上清液吸出转移到废液缸中，加入600 μL 70%乙醇洗涤1～2次后，置于室温下晾干。

（6）加入700 μL TE，然后置于50 ℃水浴锅，助溶15 min，取出放置到室温后，加入1～2 μL的RNase A溶液，37 ℃保温1 h。

（7）加入与Eppendorf管中等体积的苯酚/氯仿/异戊醇（25∶24∶1），混匀，置于离心机，室温12 000 r·min-1离心10 min抽提1次，取上清于新Eppendorf管，加入等体积氯仿/异戊醇（24∶1），混匀，室温，12 000 r·min-1离心10 min，再抽提1次。

（8）取上清，加入2倍体积含1/10体积的3 mol醋酸钠的无水乙醇，上下颠倒混匀，置-20 ℃沉淀30 min，取出置于离心机，12 000 r·min-1离心10 min。

（9）可看到白色DNA沉淀时取出，去上清，加入75%乙醇600 μL洗涤1～2次。室温下放置30 min，使沉淀干燥，加入50 μL TE溶解，置于50 ℃水浴消化助溶15 min，备用。

1.3.4 试剂盒法提取DNA 选取天根生化科技（北京）有限公司生产的植物基因组DNA提取试剂盒。

1.4 DNA的检测方法

1.4.1 琼脂糖凝版电泳检测 在1%琼脂糖（含3μL EB ）凝胶中，加入10×TBE缓冲液，85 V电压下电泳30 min，比较几种方法的DNA得率。

1.4.2 DNA样品的紫外消光值检测 将提取出的DNA样品中加入50 μL超纯水，混匀后，用石英比色杯在DU（R） 800分光光度计中测定紫外消光值，根据其在260 nm与280 nm这两个波长处的光吸收值计算出DNA产率，再根据A260/A280判断出DNA样品的纯度。

DNA样品的浓度（μg·μL-1）为在260 nm的紫外消光值×核酸稀释倍数× 50/1 000。

纯DNA样品 的A260/A280紫外消光值应为1.8，A260/A230值应大于2.0。A260 /A280值大于1.9时，表明有RNA污染；小于1.6时，表明样品中存在蛋白质或酚污染。A260/A230值小于2.0时表明溶液中有残存盐和小分子杂质，如核甘酸、氨基酸、酚等。

2 结果与分析

2.1 4种不同方法提取的DNA电泳检测结果

电泳结果显示：4种方法均可从沙枣植物嫩叶与标本叶中提出DNA，但4种方法提取出来的DNA的纯度和质量均有差异。

由图1可知，SDS法提取DNA效果很不理想，从标本叶和嫩叶中提取的DNA条带均可看见较亮的RNA带，说明提取的DNA中含有RNA。点样孔中可以看到不太明显的黑色暗沉，这说明DNA中仍然有少量杂质的残留。尤其是在标本叶中提取的DNA的条带有明显的弥散现象，说明在提取DNA过程中有降解的现象，DNA不完整，质量不高。

由图2可以看出，CTAB法提出的DNA所显示的条均无明显的弥散现象，但是比起SDS法提取的DNA条带，样孔有明显的亮点，说明其中含有较多的蛋白质、糖等杂质。这可能是由于在提取过程中抽提次数不够而造成大量杂质的残留，但是通过CTAB法提取的DNA条带并没有明显的弥散现象，说明DNA相对比较完整，没有降解现象。

由图3可知，与之前两种方法的对比，采用酚—氯仿法提取出的DNA的条带集中，没有弥散现象，说明在DNA的提取中，保存完整，没有被降解。点样孔完全没有亮点，可以证明DNA纯度高，不含有蛋白质等杂质，但是从嫩叶和标本叶中提取的DNA条带不够明亮，这可能是其中DNA含量较少的缘故。两条电泳带尾部均没有RNA条带，说明RNA去除较为干净，DNA纯度较高。

由图4可知，采用试剂盒法提取出的DNA的两个条带都很整齐、清晰，没有弥散现象，保存完整，点样孔没有出现亮点，也没有拖尾现象，证明DNA纯度高，不含有蛋白质、糖类等杂质，提取的DNA条带明亮集中，DNA的浓度高，两条电泳带尾部没有RNA亮区，说明RNA去除比较干净，DNA纯度高。

2.2 沙枣植物DNA不同提取方法纯度的比较

由表1可知，SDS法嫩叶中所提取DNA的A260/A280小于1.80，说明提取的DNA中混有蛋白质、酚类等杂质，而标本叶中所提取DNA的A260/A280大于1.90，说明提取的DNA有大量RNA的污染，标本叶A260/A230小于2.0，说明提取的DNA中有残存的小分子杂质。这就可能导致DNA降解而影响完整性和纯度，因此，用SDS法提取DNA的纯度不高。CTAB法提取沙枣的DNA，A260/A280都略低于1.8，说明提取的DNA含有少量的蛋白质、多糖等杂质。而酚—氯仿法所提取的DNA，A260/A280值在1.80～2.0之间，说明杂质去除的比较干净，所提取的DNA纯度较高，A260/A230的值小于2.0，可能是由于酚仿抽提过程中残留了部分酚类，在后来的洗涤中并没有洗干净。而试剂盒法提取的DNA的A260/A280在1.80左右，A260/A230大于2.0，可以说明试剂盒法提取的DNA比较纯净，纯度与浓度也较高。从DNA的颜色来看，酚—氯仿法提取的DNA，虽然A260/A280值都在1.80左右，但是此种方法所提取的DNA带有深褐色，SDS法与CTAB法提取的DNA也含有少量颜色，试剂盒法提取的DNA颜色残留较少，这些颜色可能是沙枣植物本身所含的酚类物质氧化所造成的，也可能是所含有的色素沉淀。

综上所述，从完整性和纯度上总体考虑，以上4种方法从沙枣叶片中提取DNA，试剂盒法相对较好，其他方法效果差些。

2.3 沙枣叶片不同储存条件提取DNA质量的比较

试验结果表明，此次试验所采取的两种材料（嫩叶和标本叶）所提取的DNA质量有一定的差异，其中试剂盒法效果最好，是此次试验中较为理想的一种方法。就试验结果对比而言，嫩叶与标本叶提取DNA的效果均不错，并没有明显的差异。说明将叶子制作成标本对其DNA的提取质量并无明显的差别。在酚—氯仿法试验中，标本叶的DNA条带较弱些，DNA质量没有嫩叶的高，因此，对于这种方法嫩叶的效果会更好些。SDS法中，标本叶有明显的弥散现象，但是嫩叶却没有，CTAB法中嫩叶和标本叶的效果也没有明显的差异，只是含有少量的蛋白质与糖类杂质。

3 结论与讨论

总的来说，以沙枣植物的嫩叶或标本叶为材料，从简便、有效的角度来说，试剂盒法提取出的DNA质量是最好的，而SDS法效果最不理想，其DNA有降解的现象，并且混有大量的蛋白质与糖类杂质；就纯度的对比而言，酚—氯仿方法稍逊于CTAB的方法。从快捷、经济角度来说，CTAB方法为最优方法，而对于在CTAB中残存的杂质，适当加入PVP和巯基乙醇能够有效去除多糖等次生物质[13]，由此而改进的CTAB方法则会成为与试剂盒法一样的最优方法。

从提取效果上对比，从沙枣植物嫩叶与标本叶中提取的DNA质量相差不大，这对于沙枣的保存办法提供了很好的依据，可以通过晒干叶片制成标本的方法保存叶片，而不用为保证叶片的新鲜而一直保存在低温中，耗费财力。特别是在野外采集过程中，这更为简便、经济。

沙枣植物叶片提取的DNA显现出不同颜色是木本植物提取 DNA中常见的问题[14]。由于木本植物体内含有较多的酚类、多糖类等次生代谢产物，它们可与DNA结合形成复合物，尤其是酚类物质经过氧化后极易与DNA共价结合引起褐变和DNA的降解[15]，并且影响之后酶切的分析结果[16]。而DNA样品中残留的多糖类物质也可能抑制PCR反应的扩增。因此，沙枣植物DNA提取出的良好结果可为后续进一步的深入研究奠定基础。

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