一株豇豆花苞内生不动杆菌的分离鉴定

韩 雪，熊燕妮，江瑞晶，曾 辰，陈禅友（江汉大学 生命科学学院，湖北 武汉 430056）

一株豇豆花苞内生不动杆菌的分离鉴定

韩 雪，熊燕妮，江瑞晶，曾 辰，陈禅友*
（江汉大学 生命科学学院，湖北 武汉 430056）

从武汉豇豆种植基地的豇豆花苞中筛选出花内生菌（命名为wjhb），其在豇豆花苞中大量存在，在花瓣中为优势内生菌。染色鉴定为革兰阴性杆菌，可以在16～43℃生长。生化试验显示，该菌生化特征符合不动杆菌特征；16SrDNA扩增产物测序后，经软件分析其16SrDNA序列与不动杆菌序列相似度达98%。本试验分离得到的内生不动杆菌（wjhb），有望成为豇豆基因工程生防菌的理想宿主菌株。

豇豆花苞；内生菌；不动杆菌；革兰染色；序列分析

豇豆（Vigna unguiculataL.），一年生蝶形花科草本植物，是豆科豇豆属植物。我国各地普遍栽培，其嫩荚和种子供食用，含丰富维生素B、C和植物蛋白质，深受广大消费者喜爱，其主要栽培在夏秋两季，田间往往虫害（如蚜虫，豆螟等）非常严重，对豇豆高产优质栽培影响很大，生产者一般通过喷施农药来防治豇豆虫害，导致产品农药残留超标，是豇豆食品安全生产中的主要障碍。为解决豇豆抗虫问题，拟从内生菌入手，探索提高豇豆抗虫性的技术方法。

内生菌是从表面消毒的植物组织中分离得到或从植物内部获得的，能够定殖在健康植物细胞间隙或细胞内，不使植物的表型特征和功能发生改变的微生物。植物内生菌由于可在植物体内定殖，菌体受植物体保护，不易受外界条件影响，可长期发挥生物学作用［1-2］；同时，在长期进化过程中，植株与内生菌形成了一种共生或互生的关系，内生菌从宿主植物中获得养分和稳定的生长环境［3-4］；因此，利用内生菌作为载体，制备基因工程益生菌和基因工程生防菌已经成为内生菌及生物防治的研究热点［5-6］。

目前，豇豆预防虫害的原则是治花不治荚，因此对于豇豆花的虫害防治是豇豆虫害防治的重点，本试验从武汉豇豆种植基地的豇豆花苞中筛选出内生不动杆菌（wjhb），在豇豆花苞中大量存在，在豇豆花瓣中也为优势内生菌，经染色鉴定为革兰阴性杆菌，可以在16～43℃下生长，16SrDNA扩增产物序列分析结果为不动杆菌，不分解淀粉，可分解油脂，在豆荚、种子、根、茎、叶中未分离出此菌。该内生不动杆菌有望成为豇豆基因工程生防菌宿主菌株。

1 材料与方法

1.1 表面消毒处理

用烧杯取豇豆花冲洗表面污垢，移至无菌瓶中。0.1%升汞振荡浸泡花3～4 min，无菌水冲洗3～4遍，再75%酒精振荡浸泡花3～4 min，无菌水冲洗5～6遍。

1.2 内生菌的分离

将表面消毒处理后的花移至无菌研钵中，剪碎，加入生理盐水和石英砂研磨，2 000 r/min离心10 min，取上清涂布于NA培养基平板，取等量最后一次水洗的无菌水作为空白对照。30℃恒温培养箱倒置培养48 h。取培养得到的单菌株做平板划线，分离提纯并保种。

1.3 革兰染色

菌液至载玻片烘干固定，结晶紫染色1 min，革兰碘液进行媒染1 min，酒精脱色，冲净，番红复染2 min，洗净，油镜镜检。

1.4 细菌基因组抽提

细菌用沸水煮10 min后，3 000 r/min离心10 min，取上清。

1.5 16SrDNA扩增

采用16SrDNA通用引物为27F，5′—GAGTTTGATCCTGGCTCAG—3′和1492R，5′—ACGGCTACCTTGTTACGACTT—3′。

1.6 聚合酶链式扩增反应

利用特异性检测引物，对提取的基因组进行PCR，PCR反应参数为:94℃5 min，按94℃30 s，58℃45 s，72℃30 s，30个循环，最后72℃10 min延伸。

1.7 序列分析

16SrDNA测序结果经过Blast在Genebank中搜索相似序列，并通过多序列对比软件Clustal分析，得到该菌种属情况。

1.8 生长温度范围

菌落涂于LB固体平板，于不同温度培养箱中培养，观察菌落生长情况，记录菌落生长情况。

1.9 糖/酸发酵试验

分别接种糖/酸发酵培养基中，置于37℃恒温培养箱，培养16 h，另外保留1支不接种的培养基对照。

1.10 硫化氢产生试验

取枸椽酸铁盐半固体培养基，穿刺接种，置于37℃恒温培养箱，培养24 h观察。

1.11 V-P试验

接种于葡萄糖蛋白胨培养基中，置于37℃，培养24 h观察，在培养液中加入40%KOH溶液10～20滴。再加入等量的α-萘酚溶液，用力振荡，再放入37℃恒温箱中保温15～30 min，观察结果。

1.12 吲哚试验

接种于蛋白胨水培养液中，置于37℃培养箱，培养24 h观察，观察时，加入乙醚1 mL，充分振荡，静置待乙醚浮于上层时，沿管内壁慢慢加入吲哚试剂10滴，观察结果。

1.13 枸椽酸盐利用试验

接种枸椽酸钠斜面，置于37℃，培养24～48 h观察。

1.14 淀粉水解试验

接种于淀粉培养基涂平板，置于37℃恒温箱，培养16 h观察。

1.15 油脂水解试验

划线于油脂培养基（使用花生油）上，于37℃恒温箱，培养16、24 h观察。

2 结果

2.1 革兰染色结果

革兰染色后，油镜下可以看到菌体为短杆状（见图1），为革兰阴性菌。

图1 革兰染色结果Fig.1 Result of Gram staining

2.2 16SrDNA测序结果

16SrDNA测序结果表明，该内生菌为不动杆菌，从所构建的16SrDNA基因进化树上来看，其与不动杆菌16SrDNA相似度达到98%，属于不动杆菌。

2.3 生理生化试验结果

由生化试验结果（见表1）可知，分离得到的内生不动杆菌可进行糖发酵，不能产H2S，V-P试验结果为阳性，吲哚试验结果为阴性，可利用枸椽酸和分解油脂，不分解淀粉。

表1 生化特性分析结果Tab.1 Results of biochemical character analysis

2.4 菌落生长温度范围

在LB固体培养基中，菌体营养体可在16～43℃温度范围内生长。

3 结语

近来，植物内生菌研究成为现代农业微生物研究的新热点，但由于相关研究起步晚，很多植物和农作物中内生菌的研究还是空白，目前，并未见豇豆中内生菌的相关报道。本试验分离得到一株豇豆花的内生不动杆菌，可以在豇豆花中进行定殖，在各期花中属于优势菌株，但在豆荚、豆、叶片和根系中没有分离到此菌。此内生菌生长温度范围为16～43℃，适合武汉地区豇豆开花结荚的夏秋两季。通过16SrDNA测序结果显示，该内生菌为不动杆菌。生理生化试验表明，该菌可发酵糖、不产气、分解枸椽酸和油脂。此外，分离得到的豇豆花内生不动杆菌（wjhb）可在豇豆花中定植生长，但不存在豆、叶及根系中，因此，是豇豆基因工程生防菌的理想宿主菌株。

（References）

［1］ 徐玲玲，单庆红，郭斌.植物内生菌研究进展及应用展望［J］.安徽农业科学，2013，41（13）:5641-5643.

［2］ 杨威，刘苏闵，郭坚华.细菌定殖能力与其生物防治功能相关性研究进展［J］.中国生物防治，2010，26（S1）:90-94.

［3］ BABALOLA O O.Beneficial bacteria of agricultural importance［J］.Biotechnol Lett，2010，32（11）:1559-1570.

［4］ SOLTER L F，MADDOX J V，VOSSBRINCK C R.Physiological host specificity:a model using the European corn borer，Ostrinia Nubilalis（Hübner）（Lepidoptera:Crambidae）and microsporidia of row crop and other stalk-boring hosts［J］.Journal of Invertebrate Pathology，2005，90（2）:127-130.

［5］ 刘峰，蒋宇扬，刘世英.植物内生菌抗虫工程研究进展［J］.生物技术通讯，2004，15（4）:417-420.

［6］ 陈泽斌，靳松，张永福.植物内生菌生物防治研究进展及存在的问题［J］.昆明学院学报，2014，36（3）:40-42.

（责任编辑:陈 旷）

Isolation of an EntophyteAcinetobactersp.from Cowpea Flowers

HAN Xue，XIONG Yanni，JIANG Ruijing，ZENG Chen，CHEN Chanyou*
（School of Life Sciences，Jianghan University，Wuhan 430056，Hubei，China）

The entophyte bacteria（wjhb）was isolated from the cowpea flowers in cowpea planting base in Wuhan，which was the dominant strain in the cowpea florescence.The proper temperature range for the entophyte bacteria culture was 16～43℃and the Gram staining result was negative.The biochemical experiment results showed the entophyte bacteria belonged toAcinetobactersp.and the biochemical character was up to theAcinetobactersp..The 16SrDNA sequence PCR results showed the similarity of 16SrDNA sequence withAcinetobactersp.reached 98%.The entophyteAcinetobactersp.（wjhb）in this paper is an ideal candidate of the host for cowpea engineered bio-control bacteria.

cowpea；endophytic bacteria；Acinetobactersp.；Gram staining；sequence analysis

S643.4

A

1673-0143（2015）05-0398-03

10.16389/j.cnki.cn42-1737/n.2015.05.003

2015-09-21

湖北省教育厅指导性项目（B2014080）；湖北省豆类（蔬菜）植物工程技术研究中心开放基金资助项目（201412）；武汉市黄鹤英才项目

韩 雪（1979—），女，副教授，博士，研究方向：微生物学。

陈禅友（1963—），男，教授，博士，研究方向：植物遗传学。E-mail：ccy@jhun.edu.cn