R NA干扰技术在肝星状细胞活化信号通路的应用

燕 晟 阳学风

南华大学附属南华医院消化内科，湖南衡阳 421001

R NA干扰技术在肝星状细胞活化信号通路的应用

燕 晟 阳学风

南华大学附属南华医院消化内科，湖南衡阳 421001

肝纤维化是各种致病因子致肝细胞损伤后的修复过度。肝星状细胞(hepatic stellate cell,HSC)的激活被认为是肝纤维化的核心环节，实验证实多条信号传导通路参与HSC的激活。RNA干扰 (RNA interference，RNAi)能有效沉默目的基因，以HSC活化信号通路为切入点，设计小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)抑制相关信号通路的活化，从而达到抑制HSC，激活是目前研究肝纤维化机制的主要手段。该研究综述了RNAi技术在研究HSC活化信号途径中的作用，以求为治疗肝纤维化提供一种新思路。

肝纤维化；肝星状细胞；信号通路；RNA干扰技术

肝纤维化是各种致病因子致肝细胞损伤后的修复过度，表现为肝结缔组织异常增生，可进一步发展为肝硬化甚至肝细胞癌，降低生活质量，出现并发症，严重危及生命。HSC是形成肝纤维化的主要细胞，它的激活被认为是肝纤维化的核心环节。多种信号传导通路与该激活过程的调控有关。RNA干扰技术（RNA interference，RNAi）能特异性沉默目的基因，针对HSC活化信号途径中的分子设计RNAi，能逆转肝纤维化。该研究着重阐述了肝星状细胞活化主要信号通路以及RNAi在这些信号通路的应用。

1 RNA干扰技术

RNAi是通过沉默目标基因以研究基因和蛋白质功能的研究手段，被广泛的用于临床疾病研究。作用的起始阶段正义链和反义链混合的双链(double-stranded RNA,dsRNA)在细胞内与核酸内切酶Ⅲ结合后，其被切割成siRNA。效应阶段siRNA则降解成正义链和反义链，后者与内切核酸酶以及其他蛋白一起形成RNA诱导的沉默复合物 (RNA-induced silengcing complex,RISC)。RISC的核酸部分与外源性基因所表达mRNA靶向结合后，在结合部位切割mRNA，随即RISC的蛋白部分引起mRNA降解。进入扩增阶段，siRNA与mRNA结合，并将结合体作为引物，从而再次形成dsRNA。靶向mRNA全部降解致使目的基因沉默。

2 RNAi对致肝星状细胞活化主要信号通路的应用

静止状态的HSC，细胞质内α-平滑肌肌动蛋白(smooth muscle actin-α,α-SMA)较少。当肝脏受损时，HSC增殖活跃，细胞外基质(extracellular matrix,ECM)分泌增多，胞质内α-SMA产生增多[1]，此即HSC活化。实验证明转化生长因子-β(transforming growth factor-β,TGF-β)信号通路、Wnt信号通路、结缔组织生长因子(connective tissue growth factor,CTGF)信号通路等均参与HSC的活化，进而参与肝纤维化的形成。而应用RNAi沉默信号通路中的各种信号分子，抑制HSC的活化，从而为治疗肝纤维化提供新的途径。

2.1 TGF-β/Smads信号通路

TGF-β是超家族TGF中的一员，其除了在ECM形成方面起着重要作用外还影响细胞的增殖、分化。不少学者发现参与肝脏损伤修复的细胞如肝细胞，枯否细胞，内皮细胞分泌大量TGFβ1，TGFβ1 通过其受体（主要为 TβRⅠ及 TβRⅡ）作用于HSC，分泌大量 ECM，其中TGFβ1被认为是致肝纤维化最强的细胞因子。TGFβ1先与 TβRⅡ结合，再与活化的 TβRⅡ激酶结合使TβRⅠ磷酸化， 然后激活 Smad2、3，Smad2、3与 Smad4结合形成异源寡聚体，最后转入胞核中发挥调控作用[2]。

有人用Smad3 siRNA转染活化的HSC后胶原Ⅰ，Ⅲ，ⅠⅤmRNA表达受到了明显抑制，说明阻断TGF-β/Smad3信号传导途径能对抗纤维化进展。郑素军[3]等将Smad3-shRNA慢病毒感染HSC-T6 3后观察细胞增殖，Smad3-shRNA组较对照组细胞增殖明显下降 (P=0．00)，表明Smad3-shRNA可阻断 TGFβ1对HSC－T6细胞的促增殖作用。而其他学者利用siRNA靶向沉默TGF-β1后，HSC激活相关指标均受到不同程度抑制，延缓肝纤维化进程，并一定程度上逆转肝纤维化。

2.2 Wnt/β-catenin信号通路

Wnt/β-catenin信号通路即经典β-catenin依赖信号通路，该通路被证实与某些癌症、纤维化疾病、炎症性肠病有关。βcatenin是该信号通路的核心部分，因为其游离态水平受肿瘤抑制因子结肠息肉基因产物、支架蛋白Axin、糖原合成酶激酶-3β构成的β-catenin降解复合体控制，在未活化细胞的细胞质或细胞核内几乎检测不到[4]，当wnt蛋白与Frizzled受体结合后经一系列反应最终导致β-catenin在细胞质积累，当积累到一定水平可发生核转移，故β-catenin在细胞核内聚集，可作为该信号通路激活的标志。

有研究发现β-catenin在活化HSC内的表达水平较静息状态提高了5～7倍[5]，目前越来越多的研究结果证实经典Wnt信号通路通过激活HSC参与了肝纤维化的形成。葛文松等[6-7]将siRNA β-Catenin转染HSC-T6细胞后，发现HSCs增殖明显被抑制，最大抑制率达到44.8±2.8%(P<0.01)；HSC细胞凋亡增加达28.6%(P<0.05)，同时下调了Ⅰ、Ⅲ型胶原mRNAs的表达。有研究证实Wnt/β-catenin信号通路通过下调PPARγ的表达而促进HSCs向肌成纤维细胞的转化[8]。Tsai等[9]利用 siRNA β-Catenin转染HSC-T6细胞，发现PPARγ表达上调，从而影响HSC的活化。

2.3 CTGF/整合素/FAK

CTGF（又称CCN2）为一种富含半胱氨酸的分泌性多肽，具有调节细胞增殖、分化、凋亡等作用，还影响着细胞迁移、黏附等功能，并影响ECM的生成。CTGF在正常肝脏组织的CTGF表达很低，然而在肝纤维化患者体内其表达显著提高。整合素是跨膜蛋白家族成员之一，由α和β两个亚基构成，亚基上的胞外区与ECM相连，同时还是CTGF的细胞表面受体。Huang等[10]证实CTGF能与HSC表面整合素α5β1受体结合，在肝纤维化发生发展过程中发挥调节细胞增殖、黏附的功能。粘着斑激酶(focal adhesion kinase,FAK)是体内非受体型酪氨酸蛋白激酶之一，与相应配体结合后经不同的信号转导通路，调节细胞生长、增殖、周期调控及凋亡等过程。FAK的N端与整合素亚基上的胞质区结合后能传递细胞外来的信号。已有研究证实HSC活化伴随着CTGF/整合素α5β1/FAK信号通路的活化并以此通路促进肝纤维化。郝春秋等[11]发现沉默CTGF后HCT-T6细胞的Ⅰ型胶原蛋白mRNA和蛋白的表达分别下调了74.21%和70.79%，同时ECM的产生受到抑制[12]。An等[13]利用RNA干扰技术沉默FAK基因能抑制HSC的增殖，并通过caspase-3和Bcl-2/Bax通路诱导HCS的凋亡。

2.4 Notch信号通路

Notch信号通路包括Notch受体、转录因子、DSL配体和靶基因这 4个核心组件，其中 Notch受体包括 Notch1、2、3、4，转录因子分别有 CBF-1、Suppressor of hairless和 Lag1， 而 Jagged1，Jagged2，Delta-like1，Delta-like3，Delta-like4 构 成 DSL 配 体 ，HES、Hey为靶基因。该信号通路通过Notch受体与配体结合，释放出 NICD（Notch intracellular domain，NICD），其核定位序列能被转运至细胞核内与CSL家族转录因子结合使靶基因表达，从而调控细胞增殖、分化和凋亡。陈毅雄[14]验证了Notch受体1-3、DSL配体Jagged1以及靶基因HES1在HSC-T6中均有表达，在用Notch3-siRNA转染HSC-T6细胞后α-SMA、Ⅰ型胶原蛋白的表达下降，而用Jagged1-siRNA转染后也有类似的作用，表明沉默Jagged1能有效抑制HSC的活化和ECM的产生。同时，研究还发现Notch3在正常肝组织中检测不到，而在慢性活动性肝炎患者肝纤维化组织中的表达明显上调，且α-SMA和Ⅰ型胶原表达增加；而沉默Notch3组中未发现上述表现[15]。

3 应用前景

近年来国内外许多研究探讨了肝纤维化的可能机制，其中HSC的激活在肝纤维化中的作用得到广泛证实。而利用RNAi抑制HSC的活化能有效减缓肝纤维化进程。研究还发现信号传导途径之间有交互作用，共沉默不同通路的信号分子有扩大抗纤维化的作用，但目前此类研究尚少且多集中在动物实验。肝纤维化发展成肝硬化后将不可逆转，若在肝硬化之前逆转肝纤维化将极大程度地减轻患者痛苦。

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The Application of RNA Interference Technique in the Signaling Pathways Involving HSCs Activation

YAN Sheng YANG Xuefeng
Affiliated Nanhua Hospital of University of South China，Hengyang ，Hunan Province，421001，China

Hepatic fibrosis is a over-healing response to multiple injuries.Activating hepatic stellate cells is considered to be the central event in liver fibrosis.Several signaling pathways involve HSCs activation.RNA interference technology is a efficient tool being applied in silencing targeted gene expression.Based on the molecular targets of the signaling pathways involving HSCs activation,individual siRNAs are be chosen to block the pathway.We review the effect of RNAi on the signaling pathways involving HSCs activation to come up with an idea treating hepatic fibrosis

Hepatic fibrosis;Hepatic stellate cells;The signaling pathways;RNA interference

R363

A

1674-0742（2015）01（a）－0074-02

国家自然科学基金项目资助（81373465）。

燕晟（1987-），女，湖北荆州人，硕士研究生，研究方向：肝病纤维化防治。

阳学风（1960.5-），男，湖南衡阳人，教授，主任医师，硕士生导师，研究方向：肝病纤维化防治，E-mail：yxf9988@126.com。

2014-10-16）