筛选高表达CPEΔN的H1299肺癌细胞株

孙静 张桂荣 王虹月 申慧

羧肽酶E（carboxypeptidase E, CPE）是一个金属离子依赖的肽链端解酶，它的生物学功能非常多元化。按照亚细胞定位的差异，CPE的功能可以被分为外肽酶功能和非酶功能两类[1]。第一部分CPE是以分泌形式表达的，这部分CPE主要分布在内分泌及神经内分泌细胞中，他们可以将激素原或神经多肽裂解为成熟的激素或神经肽，进而调节内分泌及神经信号的传导[2-8]。第二部分CPE是以非分泌性形式存在的，他们或者结合在细胞质膜上参与高尔基体的转运过程[9]；或者定位在细胞质、细胞核中参与细胞信号传导、转录调控。这部分CPE蛋白的功能是多元的，也是目前最受关注的。

近年研究者采用信使RNA（messenger RNA, mRNA）芯片技术分析了CPE在不同肿瘤细胞中的表达，结果显示在神经内分泌起源的肿瘤组织如成神经细胞瘤、胶质瘤中CPE的高表达预示肿瘤具有较好的预后[10-12]，而在一些非内分泌的肿瘤如乳腺癌、肾细胞癌、宫颈癌中[13-17]，CPE的高表达常常预示着患者的生存期短、预后差。在不同起源的肿瘤组织中CPE的功能是矛盾的且不明朗。2011年香港大学Lee的一项研究给我们带来了新的启示，他们在肝细胞癌中发现一种截短形式的CPE蛋白即CPE△N，他可以作为一个独立性指标，预测肝癌和嗜铬细胞瘤的转移和复发[18,19]。CPE△N能够与组蛋白去乙酰化酶1和组蛋白去乙酰化酶2结合进而抑制转移相关蛋白NEDD9的表达。

2013年周坤等[20,21]在结直肠癌中也发现了CPE△N的表达，并且证实在肿瘤组织中只有截短形式的CPE△N表达，CPE△N高表达的病例复发、转移率高于CPE△N低表达病例。肝细胞癌、嗜硌细胞瘤、结肠癌是起源不同的三种肿瘤类型，CPE△N高表达可以预测三者的复发，提示CPE△N很可能是一个广谱的肿瘤预测分子。

在本研究室的前期工作中，我们在9个肺癌细胞株中检测到CPE△N的表达，并且证实CPE△N的表达可以加速肺癌细胞浸润转移。为进一步明确CPE△N促进肺癌转移的易发部位，并揭示其可能分子机制，本研究选取CPE△N蛋白表达量最少的肺癌细胞株H1299作为母细胞，筛选得到了共表达荧光素酶和CPEΔN的H1299肺癌细胞株，并证实CPEΔN高表达细胞株和对照细胞株均可以有效分解荧光素酶底物，可以用于后期的小鼠活体成像实验，现将结果报道如下。

1 材料和方法

1.1 材料 慢病毒载体pCMV-GFP-LV、pLenti-CMV-MCSHA-3Flag-P2A-LUC-T2A-Puro和慢病毒包装试剂盒购自上海禾元生物；高保真酶、胶回收试剂盒、质粒抽提试剂盒购自天根生物；限制性内切酶、T4连接酶来自美国NEB公司；SYBR Premix EX Taq试剂盒购自TaKaRa，感受态细胞DH5α购自TaKaRa；H1299细胞购自上海细胞库；DMEM培养基、胎牛血清和青、链霉素购自天根生物；转染试剂脂质体2000购自Invitrogen，嘌呤霉素（Puromycin）购自翊圣公司，双荧光报告基因检测试剂盒购自Promega。

1.2 方法

1.2.1 确定慢病毒载体对H1299细胞的转染效率 将 H1299细胞接种到24孔板中，细胞数为1×104/孔。约16 h后，用带荧光标记的慢病毒载体pCMV-GFP-LV转染H1299。病毒量按如下公式计算：细胞数×感染倍数（multiple of infection, MOI）值/病毒原液滴度×103=病毒加药量。本研究的MOI值共设计了5个梯度，分别是MOI 10、MOI 20、MOI 40、MOI 80和MOI 100。完成转染后加入puromycin，使其终浓度为5 μg/mL，20 h后更换为新鲜培养基。72 h后荧光显微镜拍照，确定最佳感染条件。

1.2.2 构建CPEΔN慢病毒表达载体 CPEΔN正向引物为CGAGCTCAAGCTTCGAATTCGCCACCATGAGGCG GCGCCGGCG（含同源重组序列、kozak序列、EcoR I酶切位点和目的基因5’端配对序列）；反向引物为：TCATCCTTGTAGTCGGATCCAAAATTTAAAGT TTCTGACATCAT（含同源重组序列、BamH I 酶切位点，目的基因3’端配对序列）。扩增CPEΔN基因后，用EcoR I和BamH I酶切处理，之后与相同酶切处理的pLenti-CMV-MCS-HA-3Flag-P2A-LUC-T2A-Puro载体进行同源重组，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞。菌落PCR筛选阳性克隆，之后酶切鉴定并验证表达。

1.2.3 筛选H1299-CPEΔN和H1299-control细胞株 将H1299细胞接种到24孔板中，细胞数为1×104/孔，细胞汇合度约30%；16 h后分别转染CPEΔN慢病毒表达载体或慢病毒空载体，MOI值取20，Puromycin终浓度为5 μg/mL，24 h后换液，弃去培养基每孔加入500 μL的新鲜培养基。72 h以后，加入含2 μg/mL puromycin的新鲜培养基。每隔2-3天换液1次，药物筛选约14 d。获得高表达CPEΔN和对照慢病毒载体的H1299肺癌细胞系（分别命名为H1299-CPEΔN和H1299-control）。通过Real-time PCR和Western blot分析CPEΔN的表达，并冻存H1299-CPEΔN和H1299-control细胞株。

1.2.4 荧光素酶报告基因检测 按照荧光素酶报告基因检测试剂盒说明，裂解H1299-CPEΔN和H1299-control细胞株，检测二者分解荧光素酶底物的活性。

2 结果

2.1 慢病毒载体可以高效感染H1299肺癌细胞 为了分析慢病毒载体对H1299细胞的感染效率、优化感染条件，本研究选择了一个带绿色荧光蛋白，并且转染效率和pLenti-CMV-MCS-HA-3Flag-P2A-LUC-T2A-Puro相同的慢病毒载体pCMV-GFP-LV作为研究对象。设计了MOI 10、MOI 20、MOI 40、MOI 80、MOI 100共5个病毒转染梯度，结果显示当MOI 20、MOI 40、MOI 60、MOI 80、MOI 100时感染效率都达到80%以上（图1）。本着高效、低毒的原则，选择MOI 20作为后续病毒感染的最佳条件。

图1 分析不同MOI条件下，慢病毒载体对H1299细胞的转染效率Fig 1 The transfection efficiency of lentiviral vector in H1299 cells at different multiple of infection (MOI)

图2 CPEΔN表达载体的构建及鉴定。A：左图：菌落PCR鉴定重组CPEΔN表达载体。阴性对照（第1道），阳性对照（第2道），挑取8个菌落克隆进行菌落PCR鉴定（3道-10道）；右图：酶切鉴定重组CPEΔN表达载体；B：Western blot和Real-time PCR分析CPEΔN蛋白在CPEΔN高过表达细胞系和对照H1299细胞系中的表达；C：报告基因检测分析H1299-CPEΔN和H1299-control细胞株中荧光素酶活性。Fig 2 Construction and identification of human CPEΔN expression vector. A: Left picture, Identification of recombinant CPEΔN expression vectors using colony PCR. Negative control (lane 1), positive control (lane 2), 8 colonies picked for colony-PCR identification (lanes 3-10). Right picture,identification of recombinant CPEΔN expression vectors by restriction enzyme; B: Analysis of CPEΔN expression by Western blot and real-time PCR in H1299-CPEΔN cells and H1299-control cells; C: Luciferase reporter gene assay in H1299-CPEΔN cells and H1299-control cells.

2.2 分析CPEΔN蛋白的表达并确定其对荧光素酶底物的分解活性 通过菌落PCR和酶切鉴定，证实pLenti-CMVMCS-HA-3Flag-P2A-LUC-T2A-Puro-CPEΔN慢病毒表达载体构建成功（图2A）。加入嘌呤霉素加压筛选14 d后，获得了H1299-CPEΔN和H1299-control细胞株。通过Western blot和Real-time PCR检测两个细胞株中CPEΔN的表达。结果如图2B所示，二个细胞系中CPEΔN蛋白表达量约为4:1（凝胶灰度扫描结果），CPEΔN mRNA的比值约为2:1。

分析两个细胞系对荧光素酶底物的分解作用，每组取1×104个细胞，CPEΔN高表达细胞株的luciferase均值为19,891,000，对照慢病毒载体细胞株的luciferase均值为18,281,000（图2C），二者分解荧光素酶底物的能力没有显著差异。提示筛选到的H1299-CPEΔN细胞株在表达CPEΔN的同时，能够有效地分解荧光素酶底物可以用于后续的活体成像实验。

3 讨论

CPEΔN是2011年被鉴定出来的肿瘤转移相关蛋白。Lee等[18]证实在所有肝癌病例只表达CPE△N。当癌和癌旁正常组织CPE△N RNA比值＞2，术后2年复发率高达92.8%，中位生存时间为8.6个月；而癌和癌旁CPE△N RNA比值＜2的病例，术后2年复发率只有25.2%，中位生存时间超过90个月，组间差异具有统计学意义。2013年Zhou等[20]再次证实CPEΔN的高表达可以作为独立性指标预测结直肠癌的预后不良。在这些文献的提示下，本课题组分析了CPEΔN表达与肺腺癌预后的相关性也得到相似结论结果将在另外文章发表。

为了探索CPEΔN过表达，是否像我们预测的那样可以加速肿瘤细胞向脑、肝脏或骨组织这些代谢、增殖旺盛的区域转移，本课题设计了小鼠活体成像实验。为了尽可能地追踪肿瘤细胞去向，去除动物本底干扰，我们选择了一个经过改造的慢病毒表达载体。选择用这个表达载体主要基于3个考虑：①慢病毒载体的转染效率可以达到80%-90%，并且这种基因整合可以随着细胞分裂被传递到子代；②这个载体将目的基因和荧光素酶基因偶联在同一个启动子上，可以实现一个细胞同时表达两种蛋白，不必同时转染两种质粒再用两种抗生素加压筛选，方法学上简单、易行；③小鼠体内不表达荧光素酶，这样可以最大程度的去除本底。通过腹腔内注入荧光素酶底物，在30 min能够清晰显示肿瘤细胞在小鼠体内的分布情况。据报道通过荧光检测技术可以追踪到腹腔种植少量的肿瘤细胞，这个方法很适合观察微小转移灶。

在本研究中，我们没有选取单克隆而是选择了多克隆CPEΔN高表达细胞株。作者认为这种方式可以更直接的体现CPEΔN蛋白过表达赋予细胞的功能改变，而不是某一株单克隆细胞系的个性化行为，并且这种筛选方式可以节约成本，节省时间[22,23]。分析荧光素酶报告基因检测结果，可以看到H1299-CPEΔN和H1299-control两个细胞株降解荧光素酶底物的能力没有差异。这个工作的完成将为进一步确证CPEΔN促进肺癌转移提供动物水平佐证。CPEΔN蛋白有希望成为新的肺癌转移预测分子，用于肿瘤的个性化诊断和治疗。