琼胶降解菌在卫生检验专业综合实验教学中的应用

文/林伯坤 喻玉立 邵军丽 郭莲仙 戴娟秀 黄明元

卫生检验专业是个涉及多学科知识的专业，主要包括理化检验和生物相关检验两大方面的内容。卫生检验专业综合实验要求培养学生多学科的实验技能，培养学生开展科学研究的思维和能力，同时提高学生的学习兴趣，是基础实验的重要补充。因此，综合实验的教学内容需要满足这些要求，寻找合适的实验教学内容具有重要意义。一般的微生物不能利用琼胶，因此琼胶在微生物实验中用作培养基载体，但是有些细菌通过产生琼胶酶去利用降解琼胶，这些细菌菌落在琼胶固体培养基上形成透明降解圈，不需要碘液即可观察，非常简便和有趣。琼胶降解菌的相关研究 (筛选、鉴定和酶活测定等)涉及多个学科的实验技能，包括微生物学、生物化学和分子生物学等，有利于提高学生的综合实验技能，具有适合于开展综合实验的特点。本文根据本科生特点和知识水平，对相关的实验教学内容进行了探讨。

1.琼胶降解菌的筛选

1.1 样品采集

琼胶降解菌在自然界中分布广泛，除了海洋环境以外［1］，土壤［2－4］、河底沉积物［5］以及河水等环境中均可筛选得到琼胶降解菌。因此，结合校园环境特点和就近原则，可选择采集校园内或周边环境中的土壤、湖底/河底沉积物以及河水和湖水等样品用作琼胶降解菌的筛选。临近海洋的校园，也可选择采集海洋中的海藻、海水和海底沉积物等样品。可采样样品的多样性使得可以实行分组采样，不同组采集不同的样品。采样前向学生强调对采样相关容器和工具的灭菌处理，以确保菌株来源的准确性。

1.2 菌株筛选

琼胶降解菌的培养基会随着样品不同而不同。对于陆地环境样品，一般采用普通营养肉汤培养基或者LB培养基，对于海洋环境样品，一般采用2216E培养基。这一点内容向学生灌输了菌株筛选应根据样品而选择相应的培养基的思想。

一般采取稀释平板涂布法进行琼胶降解菌的菌株筛选，因此需要采用相应的琼胶固体培养基，这里的琼胶不仅是因为用于制作固体培养基，同时也成为琼胶降解菌的底物。琼胶降解菌因可以产生琼胶酶去降解琼胶，会在琼胶固体培养基上菌落周围形成透明降解圈，降解圈大小代表着降解琼胶的能力，肉眼可见，容易观察，如果往琼胶培养基中倾倒卢戈氏碘液，透明降解圈会更加明显易见。容易观察的琼胶降解圈因此非常适合于实验教学。

1.3 菌株的纯化

挑选产生透明琼胶圈的菌落进行纯化，加强学生在固体平板划线分离纯化菌株的技能训练，作出较美观的划线。

2.琼胶降解菌的鉴定

2.1 菌株形态和细菌染色

首先观察菌落形态和颜色，再用光学显微镜观察菌体形态，最后进行革兰氏染色试验，加强学生的显微观察技能的训练。

2.2 生理生化鉴定

选取常见的生理生化指标进行初步的鉴定，比如氧化酶、过氧化氢酶、糖类分解试验、溶血性检查、凝固酶试验和抗生素抗性。条件允许情况下，可让学生使用药敏试验的自动鉴定系统。

2.3 分子生物学鉴定

总DNA提取:让学生尝试两种总DNA提取方法，一种是传统的有机溶剂DNA提取法，一种是DNA提取试剂盒法。让学生了解DNA提取试剂盒法的原理，比较两种提取方法的优缺点。用琼脂糖凝胶电泳检测提取的DNA的质量。

16S rRNA基因的PCR扩增:虽然实验使用的16S rRNA基因的引物是直接购买回来的通用引物 (27F和1492R)，但仍然有必要向学生讲解引物设计的原理和16S rRNA基因通用引物的设计根据。这部分内容使学生掌握PCR扩增技术、PCR产物的检测分析以及回收纯化技术。

PCR产物测序及分析:将扩增得到的PCR产物与T载体连接，转化大肠杆菌，最终进行DNA测序。将测得的16S rRNA基因序列提交EzTaxon数据库［6］与现有细菌的标准菌株的相关序列进行比对，或者在Genbank数据库进行比对。根据比对结果以及菌株形态和生理生化鉴定结果确定菌株的分类归属。如果所获得基因序列与数据库序列存在差异，即可让学生将所测基因序列提交至Genbank，将会大大提高学生的学习兴趣［7］。

3.菌株的产酶检测

将琼胶降解菌培养在含有一定量琼胶的液体培养基中，诱导菌株产生琼胶酶至培养基中，通过用DNS测还原糖法测定培养液中的琼胶酶活性，计算每毫升培养液所含的酶活单位，让学生比较各自所筛选得到的菌株的产酶能力，既能加强学生的生物化学技能训练，又能提高学生的学习兴趣。

结论

琼胶降解菌的相关研究 (筛选、鉴定和酶活测定等)涉及多个学科的实验技能，包括微生物学、生物化学和分子生物学等，有利于提高学生的综合实验技能，且实验条件较易满足，实验趣味性较好，有利于激发学生的学习兴趣，具有适合于卫生检验专业开展综合实验的特点。

［1］林伯坤，陆国永，宋燕，陈鸿霖，胡忠.海洋细菌Agarivorans sp.HZ105的琼胶降解酶系.生物技术通报，2015，31(1):160－166.

［2］陈虹，张建芬，柯薇.一株琼胶酶产生菌的分离及产酶培养基优化.食品科技，2014，(4):10－14.

［3］韩文君，古静燕，李天东，等.一株产琼胶酶土壤细菌Paenibacillus sp.MY03的筛选与分子鉴定.绵阳师范学院学报，2007，26(2):86－90.

［4］Hosoda，A.，Sakai，M.Isolation of Asticcacaulis sp.SA7，a novel agar－degrading alphaproteobacterium.Biosci Biotechnol Biochem，2006，70:722－725.

［5］Rhee，Y.J.，Han，C.R.，Kim，W.C.，Jun，D.Y.，Rhee，I.K.，Kim，Y.H.Isolation of a novel freshwater agarolytic Cellvibrio sp.KY － YJ－ 3 and characterization of its extracellular β －agarase.J Microbiol Biotechnol，2010，20(10):1378 –1385.

［6］Kim，O.S.，Cho，Y.J.，Lee，K.，Yoon，S. H.，Kim，M.，Na，H.，Park，S.C.，Jeon，Y.S.，Lee，J.H.，Yi，H.，Won，S.，Chun，J.(2012).Introducing EzTaxon:a prokaryotic 16S rRNA Gene sequence database with phylotypes that represent uncultured species.Int J Syst Evol Microbiol 62，716–721.

［7］侯进慧.从淀粉酶产生菌筛选和基本鉴定谈探究性实验教学.微生物学通报，2010，37(1):127－129.