红提葡萄霜霉病拮抗菌SZ9、LT3抑菌活性物质稳定性研究

王芬　韩鹏

摘 要：为研究红提葡萄霜霉病拮抗菌SZ9、LT3无菌发酵滤液的稳定性，以红提葡萄霜霉病病原菌为指示菌，采用牛津杯法测定无菌发酵滤液的热稳定性、酸碱稳定性、储藏稳定性以及光稳定性。结果显示，两株菌的抑菌活性物质在pH 值5～9、-10～50 ℃时均表现出很强的抑菌活性，具有较好的耐储性，紫外灯照射10 h后仍具有较高的活性。研究认为拮抗菌SZ9、LT3无菌发酵滤液具有较强的热稳定性、酸碱稳定性、耐储藏和光稳定性，具有一定的开发和应用价值。

关键词：红提葡萄霜霉病；拮抗菌；生物防治；稳定性

中图分类号：S436.631 文献标识码：A DOI 编码：10.3969/j.issn.1006-6500.2015.08.027

红提葡萄霜霉病是由葡萄霜霉病菌[Plasmopara viticola（Berk.et Curtis） Berl.etde Toni]引起的真菌病害[1]。该病害遍及全国各大红提葡萄种植产区，是红提葡萄生产的一大病害，尤其是春、夏多雨年份更为严重。霜霉病主要危害红提葡萄的叶片，同时还能危害新梢、幼果和花序等部分及成熟果实，染病的植株长势极弱，果实质量差，影响当年红提葡萄的产量和品质，增加生产成本，严重的还会造成植株不能正常越冬，影响树势和来年生产，甚至整株死亡[2-5]。

目前该病的防治主要通过化学方式防治，但其往往会带来农药残留过高、严重破坏葡萄的生态环境等问题[6-7]。生物防治技术是近年来发展的一种安全、无污染、无残留的病害防治方法，不容易产生抗药性，低残留，具有对人畜无毒害、对生态环境影响小等多种优点，因此引起越来越多的人对其进行开发研究，期望其能作为病害防治的重要途径[8]。

SZ9、LT3菌株是笔者所在实验室从红提葡萄大田根际的土壤中筛选出的对红提葡萄霜霉病、白粉病、炭疽病均有较强抑菌效果的拮抗菌株，本研究提取SZ9、LT3菌株的发酵滤液，以霜霉病为指示菌，对这两株菌种的拮抗效果的稳定性进行初步探讨，以期对该病的生物防治提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 材 料

病原菌：红提葡萄霜霉病病原菌Plasmopara viticola从陕西省微生物研究所获得，病原菌接种于PDA斜面上，冰箱3 ℃保存。

拮抗菌：前期试验筛选取得，实验室NA斜面培养基保存。

培养基：NA培养基，PDA培养基，固体培养基为液体培养基，加入1.5%～2%的琼脂。

1.2 试验方法

1.2.1 拮抗菌株无菌发酵滤液的制备 用接种针挑取NA固体斜面上保存的SZ9、LT3菌种，在NA固体平板上划线，30 ℃恒温培养48 h，挑取单菌落于NA液体发酵培养基中，30 ℃，225 r·min-1摇床培养36 h。将发酵液8 000 r·min-1离心15 min，取其上清液经0.22 μm滤膜过滤，得发酵滤液。

1.2.2 拮抗菌株无菌发酵滤液拮抗稳定性测定

（1）拮抗菌株发酵滤液抑菌圈测定。以红提葡萄霜霉病病原菌为指示菌，利用牛津杯法测定发酵滤液的抑菌活性[9]。首先将病原菌液涂布于NA固体平板上，把灭过菌的牛津杯放置于平板中央，吸取1 mL的拮抗菌发酵滤液于牛津杯中，把平板放置在超净台中，直至液体完全渗透，每次试验重复3次。30 ℃恒温培养48 h后，观察结果并测定抑菌圈大小[10]。

（2）热稳定性测定。分别取SZ9、LT3菌株的发酵滤液于三角瓶中，每个三角瓶20 mL，分别在-10，0，30，50，70，90，121 ℃中处理15 min，牛津杯法测定各处理发酵液对红提葡萄霜霉病病原菌的抑菌效果。

（3）酸碱稳定性测定。分别取SZ9、LT3菌株的发酵滤液于三角瓶中，每个三角瓶20 mL，用1 mol·L-1 HCl和NaOH将发酵滤液的pH值调至3～11，静置2 h，牛津杯法测定各处理发酵滤液对红提葡萄霜霉病病原菌的抑菌效果。

（4）储存时间稳定性测定。 取SZ9、LT3菌株的发酵滤液于三角瓶中，每个三角瓶20 mL，分别放置在冰箱（4 ℃）中，以未放置处理的发酵滤液为对照，每2个月进行1次试验，牛津杯法测定各处理对红提葡萄霜霉病病原菌的抑菌效果。

（5）紫外线照射稳定性测定。取SZ9、LT3菌株的发酵滤液于三角瓶中，每个三角瓶20 mL，置于25 W的紫外线灯下，距灯5 cm处分别照射2，4，6，8，10 h，以未经紫外线照射处理的发酵滤液作对照，牛津杯法测定各处理对红提葡萄霜霉病的抑菌效果。

2 结果与分析

2.1 拮抗菌无菌发酵液热稳定性

如图1所示，随着处理温度的变化，两株拮抗菌SZ9、LT3的抑菌活性物质的抑菌能力均有变化，在-10，0，30，50 ℃ 4种温度处理下，两株菌种都保持较高的抑菌活性，其中30 ℃的处理下，抑菌活性最高。SZ9在70 ℃的处理下，活性显著下降，LT3在70 ℃的处理下活性有所下降，两株拮抗菌在90 ℃和121 ℃的处理下均基本失活。

2.2 拮抗菌无菌发酵液对酸碱的稳定性

如图2所示，随着pH值的变化，两株拮抗菌SZ9、LT3的抑菌活性物质的抑菌能力均有所变化，pH值为5～9的范围内，抑菌活性较为稳定，当pH值小于5.0或者大于9.0时，抑菌活性下降十分显著，说明这两株拮抗菌的活性物质对极端的酸碱条件比较敏感。

2.3 拮抗菌无菌发酵液储存时间的稳定性

如图3所示，随着放置时间的增加，拮抗菌SZ9、LT3的抑菌活性物质的抑菌能力表现比较稳定，说明放置时间对无菌发酵滤液的抑菌效果影响不大。

2.4 拮抗菌无菌发酵液对紫外线的稳定性

如图4所示，拮抗菌SZ9、LT3无菌发酵液在紫外光下照射2～10 h后，其抑菌活性没有显著的降低，表明两株拮抗菌在紫外线的照射下仍能保持较强的抑菌活性。

3 结论与讨论

拮抗菌防治病害是克服化学防治方法带来的生态环境破坏、毒害残留等负影响的重要手段，筛选和研发生物拮抗对于安全有效防治红提葡萄真菌病害具有重要意义[11-12]。但生物拮抗制剂在实际生产和加工的过程中，由于自身理化稳定性的影响，其抑菌物质可能会受到破坏而失活，筛选出来的拮抗菌也就不能很好地应用到生产实践中，因此，拮抗菌株的稳定性研究也十分重要[13-14]。

拮抗菌株SZ9、LT3是前期试验所筛选出来的对红提葡萄常见的真菌病害均具有较好抑菌效果的菌。本研究对其抑菌活性物质的稳定性进行了进一步的研究，结果表明，两株拮抗菌均具有较强的热稳定性、酸碱稳定性、储藏稳定性和光稳定性，具有进一步研发成生物制剂的潜力。

参考文献：

[1] 严大义.红地球葡萄[M].北京：中国农业出版社，2011.

[2] 晁无疾.红地球葡萄优质无公害栽培[M].北京：中国农业出版社，2004.

[3] 高专丽，耿有廷.提子系列葡萄栽培技术[J].内蒙古农业科技，2004（1）：30-31.

[4] 刘会宁，李华.欧亚种葡萄对白粉病与霜霉病的抗性研究[J].东北农业大学学报，2004，35（3）：302-308.

[5] 王芬.红提葡萄3种主要病害拮抗菌的筛选[J].山西农业科学，2014（12）：1 304-1 306.

[6] 王森.红地球葡萄主要病原菌的发生与综合防治[J].中外葡萄与葡萄酒，2002（1）：43-44.

[7] 张奇普，杜卫东.红地球葡萄主要病害及综合防治措施[J].河南农业科学，2002（8）：33.

[8] 龚伟，戴勤，万贵成.新疆博乐红地球葡萄生产中白粉病及霜霉病的防治[J].中外葡萄与葡萄酒，2008（3）：45-46.

[9] 刘冬梅，李理.用牛津杯法测定益生菌的抑菌活力 [J]食品研究与开发，2006，27（3）：110-111.

[10] 黄秀梨.微生物学实验指导[M].北京：高等教育出版社，1999：13-15.

[11] Yu G，Jia X，Wen J，et al.Strain improvement of Streptomyces roseosporus for daptomycin production by rational screening of He-Ne laser and NTG induced mutants and kinetic modeling [J].Applied Biochemistry and Biotechnology，2011，163（6）：729-743.

[12] Han J，Sun L，Dong X，et al.Characterization of a novel plant growth-promoting bacteria strain Delftia tsuruhatensis HR4 both as a diazotroph and a potential biocontrol agent against various plant pathogens[J].Systematic and Applied Microbiology，2005，28（1）：66-76.

[13] Hu X， Li A， Fan J，et al. Biotrestment of pnitrophenol and nitrobenzene in mixed wastewater through selective bioaugmentation[J]. Bioresource Technology，2008，99（10）：4 529-4 533.

[14] Kato S H. Stable coexistence of five bacterial strains as a cellulose-degrading community[J]. Appl Environl Mi-crobiol，2005，71（11）：7 099-7 106.