响应面优化超声辅助提取紫茄皮中花青素工艺

李 健，王金秋，刘 宁，黎晨晨

(哈尔滨商业大学食品工程学院，黑龙江省普通高等学校食品科学与工程重点实验室，哈尔滨150076)

茄子学名为Solanum melongenaL，是茄属以浆果为果实的一年生草本植物，高60～80 cm，夏秋开花结果，桨果呈球形、椭圆形，果皮多为紫红色，栽培面积广泛[1].茄子味道鲜美，营养丰富，不仅是蔬菜，还是一味中药[2].茄子性味古寒，有消肿止疼、治疗寒热、祛风通络和止血等功效[3].茄子皮中含有大量花青素，属于类黄酮物质，是一类存在于植物中的水溶性色素，颜色随着细胞液的酸碱不同而发生改变，使花辨和果实呈现五彩六色[4－5]，同时，花青素还是一种天然色素.研究表明:花青素具有很多生理活性，如抗氧化，可预防由氧化损伤所引起的糖尿病、心脑血管疾病、保护肝脏，抑制肿瘤细胞生长、抑制炎症过敏等活性[6－10].前人研究了茄子皮中色素的溶剂提取工艺[11－14]、微波辅助辅助提取工艺[15]及不同品种茄子果皮花青素含量及其稳定性[16].本研究拟以废弃的紫茄皮为原料，以花青素提取率为响应值，通过响应面法得到回归方程，分析得出相对安全、高效和简单的紫茄皮中花青素提取的最优工艺，为茄子资源的充分利用提供科学依据.

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

紫茄子，购于哈尔滨市家乐福超市.

矢车菊－3－O－葡萄糖苷(色谱纯，质量分数98%)北京方程生物科技有限公司;无水乙醇、盐酸、氯化钾、柠檬酸、冰乙酸、无水乙酸钠(均为分析纯)天津市天力化学试剂厂.

1.2 仪器与设备

KQ－500VDED双频数控超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司;EF－500摇摆式高速万能粉碎机，温岭市林大机械有限公司;LD4－2A低速离心机，北京医用离心机厂;DHG－9123电热恒温转风干燥箱，上海恒科有限公司;UV5100B紫外可见分光光度计，上海元析仪器有限公司;HWS24电子分析天平，上海恒科有限公司;HC－7P11－5架盘药物天平，上海精科科技有限公司;TU－1901双光束紫外可见分光光度计，北京普析通用仪器有限责任公司.

1.3 方法

1.3.1 紫茄皮的预处理

紫茄子清洗干净，取皮，电热恒温鼓风干燥器50℃烘干，粉碎过40目筛，得到紫茄皮粉，4℃储藏备用[17].

1.3.2 紫茄皮花青素提取工艺流程

紫茄皮粉→加入提取溶剂(乙醇)→45 Hz超声波提取→离心(3 000 r/min，10 min)→上清液→花青素粗提液

1.3.3 测定方法

花青素含量的测定方法采用pH示差法[17－20].

其中:C为提取液中花青素的质量浓度，mg/mL;V为提取液总体积，mL;N为提取液稀释倍数;M为样品的初重，mg.

1.3.4 标准曲线的绘制

1)测定波长的选择

称取矢车菊 －3－O－葡萄糖苷标准品1.0 mg，置于20.00 mL 刻度试管中，用 pH=1.0 体积分数70%乙醇溶解，定容至20.00 mL，配制成质量溶度为50 μg/mL的溶液，即为花青素标准品溶液.取花青素标准品溶液，适当稀释，在200～700 nm波长范围内进行扫描，确定花青素对照品溶液的最大吸收峰.

2)标准曲线的绘制[21]

分别取 0.10、0.20、0.40、0.80、1.60、3.20 mL花青素标准品溶液，用pH=1.0的氯化钾缓冲溶液定容至 5.00 mL;再分别取 0.10、0.20、0.40、0.80、1.60、3.20 mL 花青素标准品溶液，用 pH=4.5的无水乙酸钠缓冲溶液定容至5.00 mL.利用紫外－可见分光光度计在最大吸收波长及700 nm波长处测定其吸光度，以吸光度为纵坐标，质量浓度为横坐标，绘制标准曲线，得到线性回归方程.

3)紫茄皮花青素的定性实验

确称取紫茄皮粉1.000 g，70 mL体积分数70%pH=1.0乙醇溶液，40℃、400 W条件下超声提取30 min，3 000 r/min离心10 min，得到上清液即为紫茄皮花青素提取液，取提取液适当稀释，在200～700 nm波长范围内进行扫描，确定紫茄皮花青素的最大吸收峰.

1.3.5 单因素实验

准确称取七份紫茄皮粉各1.000 g，以紫茄皮中花青素的提取率作为评价花青素提取的标准，分别考察乙醇体积分数(30%、40%、50%、60%、

取0.80 mL花青素粗提液，分别用 pH=1.0氯化钾缓冲溶液和pH=4.5无水乙酸钠缓冲溶液定容至25.00 mL，用紫外可见分光光度计在最大吸收峰和700 nm处测定吸光度，根据公式(1)计算花青素含量:70%、80%、90%)、液料比(20∶1、30∶1、40∶1、50∶1、60∶1、70∶1、80∶1 mL/g)、提取时间(10、20、30、40、50、60、70 min)、超声功率(200、250、300、350、400、450、500 W)对紫茄皮花青素提取率的影响.

1.3.6 Box－Behnken设计确定最佳提取条件

综合单因素试验结果，依据Design Expert软件，根据Box－Behnken的中心组合实验设计原理[22－24]，设计四因素三水平的响应面实验，利用响应面结果上确定紫茄皮中花青素的最佳提取条件中.响应面实验因素水平见表1.

表1 响应面分析因子与水平表

2 结果与分析

2.1 最大吸收波长的确定及标准曲线的绘制

以矢车菊－3－O－葡萄糖苷为对照品，将其乙醇溶液绘制吸收曲线，得出在280 nm和510 nm波长下均有较大吸光度值，考虑在280 nm处，其他的黄酮类也会有最大吸收，从而干扰花青素的测定.同时，由图1可以得到紫茄皮花青素样品在510 nm和280 nm下也同样有吸收峰，说明紫茄皮中含有花青素.因此，本研究以510 nm处测得的吸光度值为标准进行花青素的含量计算.

图1 矢车菊－3－O－葡萄糖苷对照品光谱扫描曲线

图2 矢车菊－3－O－葡萄糖苷对照品标准曲线

车菊－3－O－葡萄糖苷含量与其在510 nm波长下的吸光度值之间有较好的线性关系，见图2.在此浓度范围内，得到的线性回归方程为Y=65.421X －0.004，相关系数 R2=0.999 1.

2.2 单因素对紫茄皮花青素提取率的影响

2.2.1 乙醇体积分数对紫茄皮花青素提取率的影响

图3为乙醇体积分数对紫茄皮花青素提取率的影响.随着乙醇体积分数的增加花青素的提取率先上升后下降，在乙醇体积分数为60%时提取率达到最大.可能是因为随乙醇体积分数的增加，溶剂的渗透能力也随之增加，有利于花青素水溶性物质的溶出，但乙醇体积分数高于60%，极性过低反而不利于花青素物质的溶出[25].2.2.2 液料比对紫茄皮花青素提取率的影响

图3 乙醇体积分数对花青素提取率的影响

从图4可见，固定其他因素不变，随着液料比的增加花青素的提取率先上升后下降，在液料比为60∶1mL/g时提取率达到最大.说明花青素得到充分溶解，溶液达到饱和状态，溶液中花青素含量达到最大值，当提取液继续增大时，花青素提取率下降，造成溶剂的浪费[26－27].所以选取 60∶1mL/g 为最佳液料比.

图4 液料比对花青素提取率的影响

2.2.3 超声时间对紫茄皮花青素提取率的影响

从图5可见，固定其他因素不变，当超声时间在20～50 min时，紫茄皮花青素随超声时间的延长花青素的提取率逐渐上升，继续延长超声时间，花青素的提取率开始下降.这是因为，随着超声时间的延长紫茄皮花青素不断溶出，在50 min时接近饱和，而花青素的稳定性较差，继续延长浸提时间，提取率反而稍有下降[28].

图5 超声时间对花青素提取率的影响

2.2.4 超声功率对紫茄皮花青素提取量的影响

图6为超声功率对紫茄皮花青素提取量的影响:随着超声功率的增加花青素的提取率先上升后下降，在超声功率为300 W时提取率达到最大.

图6 超声功率对花青素提取率的影响

2.3 响应面法优化实验

响应面法设计方案及结果和回归模型的方差分析见表2、3.应用Design－Expert软件对试验数据进行回归分析，得到二次多元回归模型为:

提取率/%=1.80 － 0.017A+0.055B － 0.011C －0.029D －0.053AB －0.009 125AC+0.009 575AD －0.039BC －0.012BD －0.030CD －0.050A2－0.016B2－0.069C2－0.025D2

由表3可知，模型的＜0.0001，表明模型的显著性极高，Pred R2=0.932 5，Adj R2=0.972 2，说明模型拟合良好.且由表3还可以看出，一次项A、B、C、D，二次项 A2、B2、C2、D2，交互项 AB、BC、BD、CD显著.

影响紫茄皮花青素提取率的四个因素的主次因素依次为:超声功率(B)＞液料比(D)＞超声时间(A)＞乙醇体积分数(C).利用RSM图可以更直观的看出最佳点及参数间的交互作用，如图7～12，并得到提取紫茄皮花青素的最佳工艺为:乙醇体积分数 58.81%、液料比 61.02∶1 mL/g、超声时间42.32 min、超声功率350 W，在此工艺条件下，花青素的提取率为1.89%.考虑到实际操作的方便，将提取工艺参数修正为:乙醇体积分数60%、液料比60∶1 mL/g、超声时间42 min、超声功率350 W，在此条件下实际测得的提取率为1.82%，与理论预测值相比，由此证明试验模式合理，结果理想.

表2 响应面试验设计方案及结果

表3 回归模型的方差分析

图7 超声功率、超声时间对提取率影响

图8 乙醇体积分数、超声时间对提取率影响

图9 液料比、超声时间对提取率影响

图10 乙醇体积分数、超声功率对提取率影响

图11 液料比和功率对提取率影响

图12 液料比和乙醇体积分数对提取率影响

3 结语

本实验采用超声辅助有机溶剂法提取紫茄皮中花青素，运用pH示差法计算花青素的提取率，与传统提取方法比较，超声辅助有机溶剂法从紫茄皮中提取花青素的最佳提取时间短，提取率高，超声功率为350 W、液料比为60∶1 mL/g(溶液体积/紫茄皮质量)、乙醇体积分数为60%、时间为42 min，在此条件下紫茄皮花青素提取率为1.82%.因此无论从提取量角度，还是从节省时间角度考虑，超声辅助有机溶剂法提取花青素都具有其独特的优越性[29－30].从紫茄皮中提取花青素可以充分利用茄子皮，降低环境污染，同时可生产高附加值的产品，为其他植物果蔬废弃物的利用提供参考价值.

[1]申爱民.我国茄子生产概况及发展趋势[J].现代农业科技，2008(21):64－64.

[2]张 宇.珍蔬——茄子[J].上海蔬菜，2003(2):43－44.

[3]王治业，刘晓风，王鸣刚，等.茄子皮中黄酮的提取工艺研究[J].粮油加工，2014(3):66－68.

[4]韩海华，梁名志，王 丽，等.花青素的研究进展及其应用[J].茶叶，2012，37(4):217－220.

[5]BRIDLE P，TIMBERLAKE C F.Anthocyanins as natural food colours—selected aspects[J].Food Chemistry，1997，58(1):103－109.

[6]李 敏.不同花青素提取物的组成，稳定性及抗氧化性比较研究[D].南京:南京财经大学，2013.

[7]BOWEN－FORBES C S，ZHANG Y，NAIR M G.Anthocyanin content，antioxidant，anti－ inflammatory and anticancer properties of blackberry and raspberry fruits[J].Journal of food composition and analysis，2010，23(6):554 －560.

[8]FELGINES C，TEXIER O，BESSON C，et al.Blackberry anthocyanins are slightly bioavailable in rats[J].The Journal of nutrition，2002，132(6):1249－1253.

[9]CONNOR A M，LUBY J J，TONG C B S.Variability in antioxidant activity in blueberry and correlations among different antioxidant activity assays[J].Journal of the American Society for Horticultural Science，2002，127(2):238－244.

[10]LAPIDOT T，HAREL S，AKIRI B，et al.pH －dependent forms of red wine anthocyanins as antioxidants[J].Journal of agricultural and food chemistry，1999，47(1):67－70.

[11]董丽花，闫 超.茄子皮色素的最佳提取工艺和稳定性研究[J].中国调味品，2009(12):80－83.

[12]王 川.茄子紫色素的提取工艺及稳定性研究[J].食品科学，2007，28(1):118－120.

[13]慕金超，刘春芬.紫茄皮中花青素的提取研究[J].江苏农业科学，2014，42(4):227－229.

[14]郭 菲，刘 继，黄 彭，等.响应面分析法优化紫茄皮花色苷的提取工艺[J].食品工业科技，2014，35(6):268－272.

[15]梁 党，张会香，杨世军.茄子皮中紫色素的微波法提取工艺和稳定性研究[J].食品研究与开发，2010，31(8):237－240.

[16]周宝利，张琦，叶雪凌，等.不同品种茄子果皮花青素含量及其稳定性[J].食品科学，2011，32(1):99－103.

[17]苑玉莉.紫苏中天然活性成分的提取及综合利用[D].上海:华东理工大学，2013.

[18]史光辉，胡志和，马科铭，等.紫薯花青素提取条件优化及淀粉等产物的制备[J].食品科学，2014(22):008.

[19]TEF NU M N，CTA A，POP R，et al.Anthocyanins HPLCDAD and MS characterization，total phenolics，and antioxidant activity of some berries extracts[J].Analytical Letters，2011，44(18):2843－2855.

[20]宋德群，孟宪军，王晨阳，等.蓝莓花色苷的pH示差法测定[J].沈阳农业大学学报，2013，44(2):231－233.

[21]王二雷.蓝莓花青素高纯提取物的制备技术及诱导肿瘤细胞凋亡作用研究[D].长春:吉林大学，2014.

[22]李丹丹.响应面法优化紫薯花色苷与防腐剂复配抑菌作用研究[D].南昌:南昌大学，2013.

[23]赵贝塔，刘邻渭，崔玉婷.响应面法优化超声提取墨石榴皮中花青素[J].西北农业学报，2014，23(6):201－208.

[24]吴克伟，赵晓燕，张 超，等.响应面法优化超声提取紫玉米苞叶花青素工艺条件的研究[J].中国食品添加剂，2009(3):137－141.

[25]李颖畅.蓝莓花色苷提取纯化及生理功能研究[D].长春:吉林农业大学，2008.

[26]王 海.紫甘蓝花青素的提取纯化、结构鉴定及其生物学作用的研究[D].泰安:山东农业大学，2012

[27]郭 菲，刘 继，黄 彭，等.响应面分析法优化紫茄皮花色苷的提取工艺[J].食品工业科技，2014，35(6):268－272.

[28]潘利华，王建飞，叶兴乾，等.蓝莓花青素的提取工艺及其免疫调节活性[J].食品科学，2014，35(2):81－86.

[29]王立志，唐克华.响应面法优化超声辅助提取金银木果实色素工艺[J].食品科学，2013，34(22):48－53.

[30]邹 翔，盛洁静，曲中原，等.昙花中槲皮素、异鼠李素和山奈酚量的测定[J].哈尔滨商业大学学报:自然科学版，2015，31(5):513 －515.