油橄榄果汁急性毒性及对小鼠自发活动的影响

鄢 硕，何 叶，林 彬，曹 磊，苟小军，邹 亮

(1.成都大学 基础医学与护理学院，四川 成都 610106;2.成都大学 药食同源植物资源开发四川省高校重点实验室，四川 成都 610106)

0 引 言

油橄榄属木犀科乔木，系著名的油料兼果用树种，研究发现，油橄榄果中含有大量的多酚类物质，尤其是齐墩果甙、羟基酪醇在体内和体外实验研究中均表现出极强的抗氧化活性，因此油橄榄果具有开发成含有抗氧化性效用的功能性食品潜力［1－3］.而将油橄榄作为功能性食品开发之前，需要了解其基本的安全性，但目前国内尚无油橄榄果汁安全性的数据.据此，本研究利用最大耐受剂量法评估了油橄榄果汁浓缩物的急性毒性，同时评价了其在急性和亚急性给药条件下，对于小鼠自发活动的影响，并以此评估其对于中枢神经系统的影响.

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 材 料.

实验所用材料包括:油橄榄果汁冻干粉(本实验室制备)，甲醇、磷酸和氯化钠均为分析纯(成都科龙化工试剂厂)，羟基酪醇标准品(中国科学院植物研究所).

1.1.2 仪 器.

实验所用仪器包括:JE25C21 型美的传统榨汁机(广东美的公司)，GL-21M 型高速冷冻离心机(长沙湘仪离心机仪器有限公司)，FD-IC-55 型冷冻干燥机(北京博医康实验仪器有限公司)，L-2000 高效液相色谱仪(日立公司)，TM-Vision 行为分析系统(成都泰盟公司).

1.2 实验动物

实验所用动物为SPF 级KM 小鼠25 ±2 g(达硕生物科技公司).动物饲喂的环境:12 h 白—昼循环，23 ±2 ℃温度，55% ±10%湿度控制，动物可以自由摄取食物.

1.3 实验方法

1.3.1 油橄榄果汁的制备.

油橄榄果经榨汁机榨汁后，于3 000 r/min，10 min 冷冻离心除去残渣，经低温浓缩，最后真空冷冻干燥得油橄榄果汁冻干粉.

1.3.2 羟基酪醇含量测定.

［4］的方法，利用HPLC 外标法，以羟基酪醇作为活性成分参照，流动相为，甲醇∶ 0.2%磷酸溶液=12∶ 88，C18 柱，检测波长230 nm(DAD 检测器).

1.3.3 油橄榄果汁的急性毒性试验.

采用最大耐受剂量法，设10 ×103mg/kg 和生理盐水组(Saline)，每组20 只KM 小鼠，雌雄各半.剂量设计的依据是1 ×103mg/mL 是果汁冻干粉能够配置成的最大浓度，将受试物配制成1 ×103mg/mL 溶液，以10 mL/kg 于动物空腹下一次性灌胃染毒.灌胃后观察其中毒症状、体征，连续观察7 d，判定毒性分类.

1.3.4 急性条件下对小鼠自发活动的影响.

设10 ×103mg/kg 和生理盐水组(Saline)，每组10 只雄性KM 小鼠.将受试物配制成1 ×103mg/mL溶液，以10 mL/kg，于动物空腹下一次性灌胃.灌胃5 min 后，将KM 小鼠放置于TM-Vision 行为学系统-Open Field Test 模块中10 min，软件自动记录其运动时间和运动距离.分析两组间的差异，以此来判断提取物是否对小鼠自发活动有影响.

1.3.5 亚急性条件下对小鼠自发活动的影响.

设10 ×103mg/kg 和生理盐水组(Saline)，每组10 只雄性KM 小鼠.将受试物配制成1 ×103mg/mL溶液，以10 mL/kg，每天灌胃1 次连续7 d，最后一次给药后24 h 后，将小鼠放置于TM-Vision 行为学系统-Open Field Test 模块中10 min，软件自动记录其运动时间和总运动距离，以此来判断提取物是否对小鼠自发活动有影响.

1.3.6 统计和分析.

自发活动数据数据都采用Mean ±SEM 形式表示.均值的组间差异采用one-way ANOVA 分析，post hoc 采用LSD 检验，P ＜0.05 被规定为有显著差异.

2 结果与讨论

2.1 油橄榄果汁中羟基酪醇的含量

羟基酪醇标准色谱图见图1，经HPLC 外标法测定，制备的油橄榄果果汁提取物的羟基酪醇含量纯度为5 mg/g.

图1 羟基酪醇标准品色谱图

2.2 油橄榄果汁的急性毒性试验结果

油橄榄果汁急性毒性试验结果如表1 所示.7 d观察期结束，观察未见染毒小鼠有明显中毒症状，其自发活动、刺激反射、摄食活动均无明显异常.

表1 急性毒性试验结果表

实验结果表明，油橄榄果汁对小鼠急性经口毒性LD50＞10 ×103mg/kg.说明小鼠对油橄榄果汁在最大给药量剂量下具有良好的耐受性.

2.3 急性条件下对小鼠自发活动的影响

利用开场试验评估在急性给药条件下，油橄榄果汁对小鼠自发活动的影响，结果如表2 所示.统计结果显示，两组指标均未出现差异.说明在急性条件下，最大剂量的油橄榄果汁不会显著增加和减少小鼠的自发活动，急性给药条件下，油橄榄果汁没有发现由于中枢兴奋性作用和中枢镇静效应.

表2 急性条件下开场试验结果表(n=10)

2.4 亚急性条件下对小鼠自发活动的影响

利用开场实验评估在亚急性给药条件下，油橄榄果汁对小鼠自发活动的影响结果如表3 所示.结果显示两组指标均未出现统计学水平差异.说明在亚急性条件下，最大剂量的油橄榄果汁不会显著增加和减少小鼠的自发活动，亚急性给药条件下，油橄榄果汁没有发现由于中枢兴奋性作用和中枢镇静效应.

表3 亚急性条件下开场试验结果表(n=10)

3 结 论

为了评价油橄榄果汁的急性毒性，本研究采用最大耐受剂量法来评价油橄榄果汁对小鼠的急性毒性.实验结果表明，在最大剂量下观察未见染毒小鼠有明显中毒症状，无小鼠死亡，说明油橄榄果汁对小鼠急性经口毒性LD50＞10 ×103mg/kg，具有很好的耐受性.同时，本研究还评价了油橄榄果汁在急性和亚急性给药条件下，对于小鼠的自发活动的影响.结果表明，在急性和亚急性给药条件下，给药组在开场试验中的静止时间、运动时间和运动距离同生理盐水组相比均没有统计学差异.说明油橄榄果汁在急性和亚急性条件下，对小鼠中枢神经系统既不会有兴奋刺激作用也没有镇静效应.综合以上实验结果，本研究未观察到油橄榄果汁的急性毒性和安全毒理学副作用，表明油橄榄果汁具有较高的安全性，具备开发出有效功能性食品的潜力.

参考文献:

［1］谢普军，黄立新，张彩虹，等.碱水解橄榄苦苷制备羟基酪醇及其抗氧化活性研究［J］.中草药，2013，44(15):2075－2078.

［2］刘威振，张兴，陈新建，等.羟基酪醇药理作用研究进展［J］.广东药学院学报，2012，28(6):684－688.

［3］高凤，王林，徐静，等.羟基酪醇的抗氧化作用［J］.中国食物与营养，2013，19(7):71－73.

［4］李春燕，唐远谋，梁晓玲，等.油橄榄叶中橄榄苦苷含量的HPLC-DAD 测定分析［J］.西华大学学报(自然版)，2014，33(2):40－43.

［5］Walf A A，Frye C A.The use of the elevated plus maze as an assay of anxiety-related behavior in rodents［J］.Nat Prot，2007，2(2):322－328.