DNA条形码技术在病原真菌分类鉴定中的应用

刘娜　李梦臻

摘要：病原真菌是一种具有致病性的真菌，对植物有极大的危害。DNA条形码技术是通过对足够变异、短、能够作为标准目的基因的DNA序列进行分析，并进一步对未知物种进行快速、高效地分类和鉴定或者发现新物种的一项新技术。在介绍DNA条形码技术概况的基础上，对DNA条形码技术在病原真菌分类鉴定中的应用前景进行展望，以推进我国病原真菌DNA条形码在相关研究和应用领域的发展。

关键词：DNA条形码；病原真菌；分类鉴定

中图分类号： Q949.32；S432.4+4 文献标志码： A

文章编号：1002-1302（2015）03-0010-03

真菌是自然界中一类庞大而广泛的生物类群，已确认1万余属12万余种[1-2]。病原真菌（Pathogenic fungi）是一种具有致病性的真菌，分布广泛，尤其在植物中普遍存在，70%～80%的植物病害均由病原真菌引起，对植物造成极大的危害，严重影响生态平衡[3]。病原真菌能使花草及农作物的质量受到较大程度损害，产量明显下降[4]。对物种进行正确的分类鉴定，识别每一个生物体的内部信息，如分类地位、生理生化指标和危害程度等，可以及时采取一定的措施阻止病原真菌危害[5]；因此，病原真菌分类鉴定具有重要意义。

1 病原真菌传统分类鉴定方法的不足之处

病原真菌的传统分类和鉴定主要以微观形态特征、生长特性及生理生化指标为依据，对病原真菌进行形态学、生理及生化特征等分析，并对照已有的研究资料判断它所处的分类地位以及不同菌株之间的亲缘关系。采用传统分类方法进行病原真菌鉴定费时、耗力、复杂且繁乱[6]，其不足之处具体如下所示。

1.1 病菌形态简单，分类鉴定较为困难

病原真菌形态简单，有些菌株仅用形态观察进行分类鉴定很难，如尖孢镰孢菌（Fusarium oxysporum）和串珠镰孢菌（F. moniliforme）的分生孢子都呈镰刀状，两端渐尖，菌落及显微形态特征相似，特别是有时培养物不典型或不产孢，仅用传统方法鉴定更加困难[7]。朱桂宁等对25个病害标样的12个炭疽病原菌株进行形态观察和生物学特征研究发现，炭疽病病原菌结构比较单一，传统生物学特性及致病性基本一致，病原菌形态和生物学特征均无明显差异[8]。

1.2 病原真菌形态特征易受外界环境影响

病原真菌形态特征易受培养条件和其他因素影响，生长特性和生理生化指标不稳定[9]。如炭疽菌菌丝生长和产孢受温度、pH值等生态条件和碳源、氮源等营养条件的影响较大[10]。

2 DNA条形码技术概述及其在病原真菌分类鉴定中的应用

随着分子生物学技术和一些相关学科的飞速发展以及对DNA序列认识的不断增加，人们提出利用DNA条形码进行病原真菌分类鉴定的设想[11]。从遗传本质探索病原真菌的亲缘关系，以DNA条形码技术替代传统分类方法进行病原真菌鉴定，为病原真菌的分类鉴定构建了新前景[12]。

2.1 DNA条形码技术简介

2003年，Herbert等提出DNA条形码概念[13]。生命DNA条形码协会对DNA条形码的定义是：DNA条形码为一短段能够高效鉴定物种的DNA标准区域[14]。DNA条形码技术通过对2个来自不同生物个体的较短同源DNA序列进行PCR扩增和测序，对序列进行多重比对和聚类分析，将该个体精确定位到一个已描述的分类群中[15]。DNA条形码技术可准确地辨别形态分类难以区分的病原真菌，任何生长发育时期的任何形态均可使用该技术，是传统鉴定方法所不能比拟的[16]，且易于构建统一的DNA条形码数据库，可一次性快速鉴定大量样本或者发现新物种[17]，弥补了传统分类鉴定方法的不足，这为分类学研究提供了标准快速的物种鉴定方法，并逐渐成为病原真菌分类学领域进展最迅速的前沿学科[18]。

DNA条形码需具备以下特征特性：（1）具有可以区分不同物种的足够变异性和系统进化信息[19]，同时种间存在明显的遗传变异，种间变异超过种内变异[20]；（2）在普遍的分类群中均存在，并且有利于DNA提取和PCR扩增；（3）具有高度保守的区域，便于设计通用引物[21]；（4）包含充分的系统进化信息，便于确认物种的系统地位[22-23]。

2.2 DNA条形码技术在病原真菌分类鉴定中的应用

DNA条形码技术利用病原真菌有足够变异、容易扩增、较短的标准DNA片段对物种进行分类鉴定[24]，其中， CO1和ITS等已被提出较适合作为备选片段[25]。

2.2.1 CO1线粒体DNA细胞色素氧化酶亚基Ⅰ在病原真菌中的应用 2003—2004年，已有少量学者使用CO1对真菌进行研究[26]。有研究发现，利用病原真菌CO1一段长度为648 bp（5末端开始第58～705位）的基因片断，能够在DNA水平上成功地将物种进行分类[27]，这被认为是每种生物都具有的独一无二的DNA条形码编码理想区域[28]。CO1序列拥有更多的系统发育信号，更适合于分析亲缘关系密切的分类类群[29]。Seifert等对青霉属（Penicillium）的58个物种370余份样本CO1序列进行扩增，对PCR产物进行分析，发现了4个属，并认为CO1序列适合作为青霉属分类鉴定的DNA条形码[5]。Nguyen等利用菌物的CO1序列进行研究，发现锤舌菌属（Leohumicola）的3个新种，CO1序列作为该类群有效的物种分类鉴定条码，可以发现菌物的隐藏种和新种[30]。Martin对疫霉属（Phytophtora spp.）CO1和CO11基因进行研究发现，利用CO1和CO11基因相结合对物种进行分类鉴定，比单一考虑ITS序列更加稳定可靠[31]。

2.2.2 ITS 核糖体转录间隔区在病原真菌分类鉴定中的应用 转录间隔区是位于18S rDNA和5.8S rDNA之间及5.8S rDNA和28S rDNA之间的区域片段[9]，是目前真菌物种分辨率最高的单一DNA片段。该基因片段虽然较短，但人们可以从不太长的序列中获得足够的信息，有更高的PCR扩增成功率，进行测序和克隆也比较容易[32]。种内的不同菌株之间高度保守，但在种间变化极大，近缘的种属也能够通过ITS序列上的不同而加以鉴别。Landeweert等认为，真菌通过ITS区域比对，序列相似性小于95%，鉴别为同科；序列相似性大于95%且小于99%，鉴别为同属；序列相似性大于99%，鉴别为同种[33]。没有一种单一线粒体基因在病原真菌分类鉴定上比ITS基因更加合适[34]。

段维军等对轮枝菌的ITS片段进行研究，成功区分了所涉及的10个种，ITS序列是轮枝菌理想的DNA条形码，能对物种或未知菌进行准确分类鉴定[35]。Bryn等通过ITS序列对伞菌亚门（Agaricomycotina） 进行研究，发现ITS基因比CO1基因更适合作为该类群的DNA条形码[36]。Boyanton等对60株念珠菌属（Candida）进行ITS2序列扩增，并进行菌种分类鉴定，检测出8种不同菌株，其结果与生化检测和形态学鉴定结果一致，且所用时间均比两者短[37]。Sert等利用ITS序列和18S rDNA片段，对古代大理石纪念碑中的250个黑色真菌样品进行研究，发现其中有99种不同的真菌菌株，它们全都是子囊菌的新种[38]，利用DNA条形码技术对物种进行分类鉴定，不受物种生长时期的限制。Feau等对8个不同的栅锈菌（Melampsora）物种的形态学特征和DNA条形码进行比较，纠正加拿大标本馆的错误定名，证明Melampsora aecidioides与栅锈菌属的其他4个种密切相关但不相同[39]。李依韦等应用ITS序列进行腐霉菌（Pythium）的分子鉴定及菌群之间的系统发育分析，从形态学角度对腐霉菌的分类起到了修正和补充的作用[40]。

3 展望

目前，病原真菌的分类鉴定方法多种多样。依据病原真菌的形态特征、生长特性以及生理生化指标进行分类鉴定的传统方法，由于受到许多客观因素影响，测定指标往往不稳定，给病原真菌的分类鉴定带来严峻挑战。随着分子生物学的飞速发展和不断成熟，一种高效的标准化分子生物学鉴定体系——DNA条形码技术应运而生[41-42]。DNA条形码技术为探测未知物种和识别病原菌提供了大量数据，成为阐明宿主寄生和共生关系的一种有效的工具[43]。需要说明的是，DNA条形码技术也有一定的局限性，适用于所有物种的DNA条形码是基本不存在的，在对不同物种类群进行分类鉴别时需要用不同的目的基因[14]。DNA条形码技术是传统鉴定方法强有力的补充，有着其他方法不可比拟的优势，已在病原真菌的研究中得到广泛应用，已经成为病原真菌分类鉴定的有力工具，解决了许多重要的生物问题，为国家经济和生态环境建设、生物多样性维护、生物安全保障、物种保护等科学领域开辟了一个新的方向[24]。

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