5种长白山有毒真菌提取液的抑菌杀虫活性

王丰　范余娟

摘要：以5种长白山有毒真菌为原料，对其活性成分的提取工艺进行初步研究，并对提取液的抑菌作用及其对榆绿毛萤叶甲、蚜虫的杀虫活性进行研究。结果表明，提取液对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌均有明显的抑制效果，对酵母、青霉、米根霉、黑曲霉的抑菌效果不明显；提取液对榆绿毛萤叶甲、蚜虫的致死效果从强到弱依次为红柄牛肝菌>红菇>毛头乳菇>鹅膏菌>皂味口蘑。

关键词：长白山；有毒真菌；提取液；生物活性；抑菌效果

中图分类号： Q939.9 文献标志码： A

文章编号：1002-1302（2015）03-0126-04

生物源农药因具有对人、畜安全，不污染环境，不易引起抗药性，在自然环境中易降解等特点，已引起国内外学者高度重视，并成为当今农药研究的热点[1]。研究发现，一些大型真菌的子实体从来不被昆虫侵袭，受伤后的子实体及其发酵培养物中可以产生具有抗真菌、杀虫等多种活性的次生代谢产物[2-3]。通过对一些大型有毒真菌的子实体或代谢产物进行抗虫活性试验发现，大型有毒真菌中含有的多种抗虫活性物质如毒蝇碱、毒肽、毒伞肽等可以直接用于毒杀害虫，也可以作为生物源农药研究和开发的材料。目前利用大型真菌提取物在黏虫、桃潜叶蛾、棉铃虫、小菜蛾的拒食和毒杀活性方面的研究已有报道，但是在蚜虫、榆绿毛萤叶甲方面的研究报道较少，笔者用85%乙醇提取长白山有毒真菌的有效成分，并对其生物活性进行研究，旨在为充分开发利用该植物资源奠定基础，并为有毒真菌的高效利用提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

供试菌种：枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、青霉、米根霉、黑曲霉、酵母（由吉林农业科技学院实验室提供）；有毒真菌：红柄牛肝菌、红菇、毛头乳菇、皂味口蘑、鹅膏菌（采集于白山市八道江镇长白山原始林区）。

试验仪器：722型紫外可见分光光度计（上海光谱仪器有限公司）、电子恒温水浴锅、高温高压蒸汽灭菌锅等。

主要试剂有乙醇、三氯甲烷、丙酮、石油醚、牛肉膏、蛋白胨等，均为分析纯。

1.2 试验方法

1.2.1 真菌提取液的制备 将采集于白山市八道江镇长白山原始林区的野生有毒真菌在室温下避光晾干后粉碎成粗粉，通过单因素试验和正交试验（表1、表2），找到超声辅助乙醇提取的最佳工艺条件[4-5]。

确定最佳条件为A1B2C2D2，即料液比为1 g ∶30 mL、提取时间为30 min、提取温度为40 ℃、乙醇浓度为85%，在此条件下制备真菌提取液备用。

1.2.2 真菌提取液的抑菌性测定 采用滤纸片法测定真菌提取液的抑菌性：在牛肉膏蛋白胨培养基平板上分别涂布02 mL金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌菌悬液，在PDH培养基平板上分别涂布0.2 mL米根霉、青霉、酵母、黑曲霉悬液；然后将灭过菌的滤纸片浸在提取液中，放入培养皿中，细菌指示菌（金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠杆菌）于30 ℃培养，霉菌指示菌（米根霉、青霉、酵母、黑曲霉）于 35 ℃ 培养，做3～4个平行，细菌置于30 ℃培养箱中培养 24 h，霉菌置于35 ℃培养箱中培养24 h后，测量滤纸片抑菌圈直径大小，抑菌圈越大，表明抑菌效果越好。

1.2.3 真菌提取液对榆绿毛萤叶甲的杀虫活性测定 榆绿毛萤叶甲的浸渍法（即喂毒和触杀法）处理：将榆绿毛萤叶甲采集到干燥的塑料瓶中备用，共采样18份。预先准备18个纯净的塑料瓶，用剪刀将瓶口剪大，剪取18片足够包裹住瓶口的纱布，并分别在纱布上做记号，另外准备18根皮套及若干棉花团、棉花片备用。每种粗提液做3组对照，将5种粗提液分别倒入5个小烧杯中，分别浸泡榆绿毛萤叶甲5 s，将浸泡后的榆绿毛萤叶甲分别放置在18个纯净的塑料瓶中，在瓶中放入一小团稍微捏干（水不会流出）的湿棉花，且在每个瓶子中放入2张榆树叶，将棉花片浸湿后稍微捏干放置在瓶口，一半遮盖一半敞开，然后用纱布包裹住瓶口，再用皮套系牢，防止虫子从瓶中跑出。以清水作对照，所有步骤处理好后，置于25 ℃恒温培养箱中培养。

1.2.4 真菌提取液对蚜虫的杀虫活性测定 蚜虫的浸渍法（即喂毒和触杀法）处理：采集带蚜虫的叶片（带茎），将大虫用挑针剔除，在培养皿中装一半沙子，加水浸湿后将水倒出，在培养皿上盖1层培养皿口大小的报纸，其上挖1个小洞（每种粗提液做3组，1组培养24 h，另一组培养48 h，共需准备36个这样的培养皿，分别做好标记），准备好待用。将5种粗提液分别倒入5个小烧杯中，分别浸泡蚜虫5 s；另以清水作对照。将处理好的带蚜虫叶的茎插入到待用培养皿上报纸的小洞中，有蚜虫的一端朝上。所有步骤处理好后，置于25 ℃的恒温培养箱中培养。

2 结果与分析

2.1 有毒真菌提取物对榆绿毛萤叶甲的作用

将按“1.2.3”节步骤处理的榆绿毛萤叶甲培养24 h后，打开纱布，查看并统计虫的死亡数（用镊子轻轻碰触，腿会动弹的为活虫，反之为死虫），结果见表3。

从表3、表4可以看出，经浸渍法处理24、48 h后的榆绿毛萤叶甲在清水中全部存活，而在红柄牛肝菌溶液中的死亡率最高，红菇次之，乳菇再次之，且在这3种溶液中的死亡率都达到了70%以上，说明这3种溶液对榆绿毛萤叶甲有强的致死作用，在皂味口蘑和鹅膏菌溶液中的死亡率均为40%左右，说明它们对榆绿毛萤叶甲致死作用相对较弱。

从表5、表6中可以看出，有毒真菌原液稀释10倍后的致死效果仍是红柄牛肝菌>红菇>毛头乳菇>鹅膏菌>皂味口蘑，但榆绿毛萤叶甲的死亡率降低将近一半，总的来说，还是有致死效果的。

由表7、表8、表9可以看出，有毒真菌原液稀释20倍的死亡率为0，但将榆绿毛萤叶甲浸泡在稀释后的粗提液中5 s后，榆绿毛萤叶甲的动态不同，活泼榆绿毛萤叶甲的数量排序为清水>皂味口蘑>鹅膏菌>毛头乳菇>红菇>红柄牛肝菌，说明毒性顺序依次增强；同时发现，在清水中的榆绿毛萤叶甲异常活泼（在瓶子中上下爬行），在红柄牛肝菌稀释液中的榆绿毛萤叶甲虽然没死，但榆绿毛萤叶甲的行动能力明显减弱，一般聚集在瓶子的底部，只有1～2头在瓶壁缓慢爬行。

从表10、表11可以看出，经浸渍法处理24、48 h后的蚜虫在清水中全部成活，而在红柄牛肝菌溶液中的死亡率最高，红菇次之，乳菇再次之，且在这3种溶液中的死亡率都达到了60%以上，说明这3种溶液对蚜虫有强的致死作用；在皂味口蘑和鹅膏菌溶液中的死亡率均在33%～42%，说明这2种溶液对其致死作用相对较弱。

从表12、表13中可以看出，有毒真菌原液稀释10倍后的致死效果从强到弱仍是红柄牛肝菌>红菇>毛头乳菇>鹅膏菌>皂味口蘑，但蚜虫的死亡率降低将近一半，总的来说，还是有致死效果的。

从上述数据可以看出，致死效果为红柄牛肝菌>红菇>毛头乳菇>鹅膏菌>皂味口蘑，将原液稀释10倍，蚜虫的死亡率将近降低一半，而将原液稀释20倍，蚜虫的死亡率为0，说明在这些菌液中能致死的成分不多。

2.3 抑菌作用

提取液对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌均有明显的抑菌效果，对酵母、青霉、米根霉、黑曲霉的抑制效果很弱。用浓缩液对4种霉菌做抑菌性试验，抑菌效果仍然不明显。由此可以推断，鹅膏菌提取液对细菌的抑制活性从强到弱依次为金黄色葡萄球菌>枯草芽孢杆菌>大肠杆菌，对4种霉菌抑制活性不明显（表17）。

3 结论

本研究表明，有毒真菌提取液对金黄葡萄球菌、大肠杆菌、枯草杆菌均有明显的抑菌效果，对酵母、青霉、米根霉、黑曲霉的抑菌效果不明显；提取液对榆绿毛萤叶甲和蚜虫的致死效果排序为红柄牛肝菌>红菇>毛头乳菇>鹅膏菌>皂味口蘑，将原液稀释10倍，榆绿毛萤叶甲的死亡率将近降低一半；将原液稀释20倍，虫的死亡率为0，说明在这些菌液中能致死的成分不多。

参考文献：

[1]李首昌，刘凤沂，马建华. 生物农药的开发与应用[J]. 现代化农业，2002（7）：10-11.

[2]刘吉开. 高等真菌化学[M]. 北京：中国科学技术出版社，2004.

[3]高锦明. 高等真菌代谢产物[M]. 杨凌：西北农林科技大学出版社，2003.

[4]王 丰，赵 权. 串红花色素的提取与稳定性研究[J]. 江苏农业科学，2010（6）：473-475.

[5]王 丰，赵 敏，薛晓丽.杭白菊多糖超声提取工艺的研究[J]. 北方园艺，2012（2）：28-31.