硫磺菌液体培养条件的优化研究

孙文军 汪鋆植 张 盼 贺海波 黄文峰 张 琳

（1.三峡大学 生物与制药学院 天然产物研究与利用湖北省重点实验室 ＆湖北省土家族医药研究所，湖北 宜昌 443002；2.三峡大学 医学院，湖北 宜昌 443002）

齿孔酸（Eburicoic acid）是硫磺菌主要成分之一，具体保肝、抗炎、抗癌等多种活性［3－5］，可衍生为羊毛甾－9－烯，用作有机合成原料，因此，齿孔酸具有很好的利用前景.本试验以菌丝产量和齿孔酸含量为指标，对硫磺菌液体培养的培养基条件进行优化.

1 材料与仪器

1.1 供试菌种

硫磺菌菌种由三峡旅游职业技术学院王绍柏老师提供.将硫磺菌菌株接种于PDA培养基上，25℃培养一周，4℃保藏.

1.2 培养基

1）平板培养基：PDA固体培养基，供活化菌种用.2）摇瓶菌种培养基：新鲜无病害马铃薯200.0g（取煮液），酵母浸膏5.0g，葡萄糖20.0g，加水至1 000mL，pH自然.3）发酵液体培养基：取干木瓜沸水煮30min，过滤得滤液，向滤液中加入相应量的葡萄糖、黄豆粉和KH2PO4（详见表1）.

1.3 仪器

KQ－500DB型超声波清洗仪，艾朗旋转蒸发仪（德国），ME215S型十万分之一电子天平（德国Sartorios公司），25kg电子天平，高效液相色谱仪（DIONEX Ultimate 3000，美国戴安液相色谱有限公司），冷冻干燥机（FREEZ0NE PLUS 6，LABCONCO）.

1.4 试剂

齿孔酸（天然产物研究与利用湖北省重点实验室提供），酵母浸膏和琼脂粉（北京奥博星生物技术有限公司），葡萄糖和KH2PO4为分析纯.

2 试验方法与结果

2.1 液体培养基正交试验设计

正交试验优选最佳摇瓶培养基：以每瓶菌丝体中齿孔酸的含量为评价指标，采用正交试验L9（34）对基本发酵培养基优化，从而筛选液体发酵最佳培养基，正交试验因素水平见表1.

表1 培养基正交试验因素水平（g／L）

2.2 培养方法

1）菌种活化：从母种试管中切出0.5cm2大小的菌丝块接种于平板培养基的中部，培养5d后待用.

(3) 伴有症状的T波一过性高尖呈“帐篷状T”或一过性倒置呈“冠状T”，持续1 min；两次发作间期≥1 min。

2）菌种液体培养：种子液的制备，取1cm2大小的活化菌种2～3块接种于基础培养基中（200mL培养基于500mL三角瓶），置于25℃旋转式摇床上180 r／min振荡培养5d；然后进行液体培养，取长满菌球的液体菌种，按5%的接种量接入各种试验培养基中，每种培养基平行做4瓶，静置培养15d.

2.3 硫磺菌菌丝体中齿孔酸含量测定（RP－HPLC法）［6］

2.3.1 对照品溶液制备

精确称取齿孔酸，用色谱级甲醇分别配成7.5，6.0，4.5，3.0，1.5mg／mL溶液，经0.22μm滤膜过滤后作为对照品溶液.

2.3.2 样品溶液制备

将硫磺菌菌丝体于50℃烘箱中烘干，取各组干燥菌丝体0.15g经色谱级甲醇10mL 50℃超声提取1h，0.22μm滤膜过滤后，用色谱级甲醇定容至10 mL作为待测样品溶液.

2.3.3 标准曲线绘制

分析条件：色谱柱Diamonsil C18（250mm×4.6 mm.id.，5μm），柱温25℃，流动相：乙腈10%～100%，超纯水90%～0%，洗脱时间为30min；100%乙腈，10min；共计40min.检测齿孔酸波长设定为203nm，进样10μL不同浓度的对照品溶液，计算标准曲线：齿孔酸酸标准曲线y＝19.07x＋3.378，r＝0.999 7.标准曲线在齿孔酸质量浓度：7.5～1.5mg／mL之间时，线性较好（如图1所示）.

2.3.4 样品溶液的检测

进样10μL样品溶液，分析条件同标准曲线绘制条件，样品溶液高效液相分析图谱如图2所示.

图1 对照品齿孔酸HPLC图谱

图2 硫磺菌菌丝体进取提取物HPLC图谱

2.3.5 稳定性试验［7］

取一样品溶液，分别在0h，4h，8h，12h，16h，20 h，24h进样检测方法的精确性，RSD＝2.47%，该方法24h内稳定性较好.

2.3.6 重复性实验

取对照品10μL，重复5次进样，计算RSD，检测方法的重复性，RSD＝1.46%，方法重复性良好.经计算，各组干菌丝体和菌丝体中齿孔酸的含量见表2.

表3 齿孔酸含量极差分析

图3 不同培养基对菌丝体中齿孔酸含量的影响

通过正交试验，从9组试验的菌丝体中齿孔酸的含量来看，组合2的菌丝体中齿孔酸的总量最高，总量为23.98mg.经极差和直观分析图分析可知，较优组合为A1B2C2D3，即在最佳液体培养基中，葡萄糖15g／L，黄豆粉1.5g／L，KH2PO42.0g／L，木瓜煎液（相当于干）100g／L.从极差分析结果（表2）可以看出，RD＝9.73＞RA＝4.18＞RC＝4.06＞RB＝2.59，影响菌丝体中齿孔酸含量的因素分别为D＞A＞C＞B，说明在4个因素中，液体培养基中木瓜煎液浓度对菌丝体中齿孔酸的含量影响最大，其他3个因素依次是葡萄糖、K2HPO4、黄豆粉.

2.3.7 加样回收试验

精密称取已知含量样品5份，加入与样品含量相当的对照品，测定齿孔酸含量，计算回收率，结果见表4.

表4 齿孔酸加样回收率（n＝5）

2.4 实验重复性

将上述中A1B2C2D3培养基平行作4瓶，培养15d，称取菌丝体干重和测定菌丝体中齿孔酸含量用以检验上述实验的重复性，结果见表5.

表5 硫磺菌菌丝体中齿孔酸含量

表5中600mLA1B2C2D3培养基可产3.6g干菌丝体，单位菌丝体中齿孔酸含量为7.12mg／g，齿孔酸总含量为25.6mg，与表2中A1B2C2D3培养基比较无显著差异，表明该条件可用于硫磺菌液体培养.

3 讨 论

硫磺菌是土家族人喜爱的山珍美味，其外形似展开的鹰翅膀，同时具有增强体质的作用，故土家族人常称之为鹰翅膀.硫磺菌具有很好的利用前景，但其自然资源少，人工培育成为规模化生产供应的重要途径，但目前对硫磺菌功能性成分的制控研究较少，为更好控制硫磺菌质量，为硫磺菌发酵培养和人工培育提供依据，本试验选择齿孔酸含量为指标，对硫磺菌液体培养的培养基条件进行优化.

前期筛选表明硫磺菌在加入木瓜的PDA培养基上生长速度明显高于普通的PDA培养基；葡萄糖和黄豆粉是微生物液体培养基中常用的碳源和氮源；KH2PO4可提供磷元素与钾元素；因此，选择葡萄糖、黄豆粉、KH2PO4、木瓜进行正交实验.齿孔酸主要存在于硫磺菌菌丝体中，发酵液中含量极少，考虑到震荡培养菌丝体很容易混入培养基中其他的物质，影响定量，因此该实验以静置培养以便获得尽可能干净的菌丝体.实验表明木瓜是影响菌丝体中齿孔酸含量的主要因素，可能与木瓜中富含齐敦果酸等三萜类成分影响齿孔酸的合成有关，但其具体机制有待进一步研究.

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