黄芩素对慢性萎缩性胃炎大鼠胃粘膜保护作用的实验研究※

● 田 华 王小平▲ 张峰利



黄芩素对慢性萎缩性胃炎大鼠胃粘膜保护作用的实验研究※

● 田 华1王小平1▲张峰利2

目的：从抑制慢性炎症反应的角度探讨黄芩素对慢性萎缩性胃炎(CAG)大鼠胃粘膜的保护机制。方法：SD大鼠随机分为空白对照组、模型对照组、维酶素阳性对照组、黄芩素高(200mg·kg-1)、中(150mg·kg-1)、低(50mg·kg-1)剂量干预组，除空白对照组外，各组均CAG造模，造模28周后开始灌胃给药，连续10周后ELISA法检测白细胞介素-8(IL-8)含量，免疫组化法检测热休克蛋白70(HSP70)、核转录因子-κB(NF-κB)和环氧合酶-2(COX-2)的蛋白表达。结果：黄芩素高、中剂量组的大鼠体征状况与空白组相似；黄芩素高、中剂量组能显著降低CAG大鼠的IL-8、NF-κB和COX-2含量，提高HSP70含量。 结论：黄芩素可能通过降低CAG大鼠的IL-8、NF-κB和COX-2含量从而阻断了慢性炎症对胃粘膜长期、反复的损伤，并通过提高HSP70含量使胃黏膜的抗炎性损害能力增强，从而起到预防、治疗慢性萎缩性胃炎的保护作用。

慢性萎缩性胃炎 黄芩素 白细胞介素-8 热休克蛋白70 核转录因子-κB 环氧合酶-2

慢性萎缩性胃炎(CAG)是一种常见病、多发病，其发病率居各类消化系统疾病前列。它是多种致病因素长期作用下，以胃粘膜萎缩为主要特征的一种常见的慢性消化系统疾病，临床上主要表现为上腹不适、食纳减少、消瘦乏力等非特异性症状。病理改变可见胃黏膜上皮和固有腺体萎缩，数目减少，黏膜变薄，或伴幽门腺化生、肠腺化生和不典型增生[1]。若不积极治疗，可发展为胃癌，被认为是一种癌前病变，严重危害健康[2]。黄芩素为唇形科植物黄芩的主要活性成分之一，属于酚类的抗氧化剂[3]，具有较强的抗炎活性和抗肿瘤作用[4]，有研究发现其对胃癌有一定的抑制作用。本实验主要从抑制慢性炎症反应的角度探讨黄芩素对CAG大鼠胃粘膜的保护机制，旨在为中药预防、治疗慢性萎缩性胃炎提供一定的实验依据。

1 材料

1.1 动物 SD大鼠，雌、雄各半，体重 ( 250±5) g，购自第四军医大学实验动物中心[许可证号： SCXK (军) 2009-005]。实验室饲养温度(20±2)℃，所有动物适应性喂养1周。

1.2 药品与试剂 黄芩素由陕西中医学院中药制剂设计研究室提供，纯度>98%； (N-甲基-N'-硝基-N-亚硝基胍(MNNG)购自萨恩化学技术有限公司(批号：MV340-RG)；维酶素片购自北海阳光药业有限公司(批号：101120)；IL-8检测试剂盒购于南京建成生物工程研究所(批号：H008)；兔抗鼠HSP70多克隆抗体(批号： BAO101055)、兔抗鼠NF-κB多克隆抗体(批号：BAO101055)、羊抗鼠COX-2多克隆抗体(批号：BAO101023)和DAB显色剂(批号：SA2023)均购自武汉博士德生物工程有限公司。

1.3 仪器 光学显微镜 (尼康 DXM1200F型) ，倒置显微镜 (尼康 TS100型) ，低温恒冷切片机(KD-2800型)，台式高速离心机(GENIUS 16K型)，石蜡包埋机(EG1140型)，脱水机(TP1020)，烘片机(ZMN200型)，石蜡切片染色机(5010型)。

2 方法

2.1 造模 除空白对照组外，其它实验组小鼠用MNNG复合法造模[5]：饥饱失常(每进食1d，禁食1d)，烫热高盐饮食(禁食日3pm用56℃、15%NaCl溶液按10mL·kg-1灌胃)，供给150mg·L-1MNNG溶液(代替饮用水)，0.03%雷尼替丁饲料。进行28周。

2.2 分组与给药 造模28周后，CAG大鼠随机分成5组，即模型对照组、维酶素阳性对照组(200mg·kg-1)、黄芩素50，150，200mg·kg-1组[6]，每组12只。每天9am～10am给药，连续10周。

2.3 大鼠体征观察 观察大鼠毛色、粪便、活动度等一般情况。

2.4 IL-8检测 取每组大鼠胃组织100mg，加冰生理盐水2mL后匀浆，35000r·min-1离心10min后取上清液，按试剂盒说明采用ELISA方法检测IL-8。

2.5 NF-κB、COX-2、HSP70检测 石蜡切片常规脱蜡后，3%H2O2灭活内源性酶，室温孵育20min，微波进行抗原修复10min后5%牛血清封闭。加兔抗大鼠一抗，4℃孵育过夜，NF-κB、COX-2、HSP70 1∶100稀释液。以PBS 代替一抗做阴性对照，以1%的DAB显色，双蒸水终止反应，苏木精复染，用中性树胶封片。采用免疫组化法测定NF-κB、COX-2、HSP70的蛋白含量，通过软件Image-Proplus6.0计算平均光密度值(OD)。

3 结果

3.1 大鼠的体征情况 空白对照组大鼠的毛色光亮，反应灵敏，粪便成形。模型对照组大鼠瘦小，皮毛无光泽，反应迟钝，部分大鼠大便不成形，粪便臭味重。给药10周后，黄芩素150，200mg·kg-1组及维酶素阳性对照组大鼠体形较前变胖，皮毛较前光泽度明显提高，活动度增加，反应较前灵敏，粪便较前成形。而黄芩素50mg·kg-1组与模型对照组的大鼠一般情况相似。

3.2 黄芩素对CAG大鼠IL-8的影响 模型组大鼠IL-8含量高于正常组大鼠(P<0.05)，黄芩素150，200mg·kg-1组及维酶素阳性对照组IL-8值均低于模型组(P<0.05)，而黄芩素50mg·kg-1组与模型组的IL-8含量无统计学差异(P>0.05)。见表1。

表1 黄芩素对CAG大鼠IL-8的影响

注：与空白组比较△P<0.05，与模型组比较*P<0.05。

3.3 黄芩素对CAG大鼠NF-κB、COX-2、HSP70蛋白表达的影响 模型组大鼠NF-κB、COX-2含量均高于正常组(P<0.05)。黄芩素150，200mg·kg-1组及维酶素组NF-κB、COX-2含量均低于模型组(均P<0.05)，HSP70含量高于模型组(P<0.05)。而黄芩素50mg·kg-1组与模型组的NF-κB、COX-2、HSP70含量无统计学差异(P>0.05)。见表2。

表2 黄芩素对GAP大鼠NF-κB、COX-2、HSP70蛋白表达的影响

注：与空白组比较△P<0.05，与模型组比较*P<0.05。

4 讨论

世界卫生组织( WHO) 已将慢性萎缩性胃炎定义为癌前状态，其具有一定的癌变率，严重危害人类的健康[7-9]，若能对慢性萎缩性胃炎进行积极治疗，则能阻断其进一步发展为胃癌。该病病因复杂，病机不明，给治疗带来了一定的难度。研究表明，该病是在免疫、遗传、幽门螺杆菌感染(HP)、饮食不当及滥用药物等因素长期复合作用下[10]，首先引起胃粘膜局部炎症，进而影响到胃粘膜的血运循环，使胃黏膜的屏障遭到了破坏，粘膜固有腺体开始萎缩，粘膜变薄甚至伴有肠上皮的化生、异型增生而最终导致的。

当这些致病因素作用于胃粘膜时，胃粘膜受到刺激后首先释放炎性趋化因子IL-8，引起局部的炎症反应。这种局部的炎症反应引起胃粘膜发生早期的损伤。炎性因子IL-8进一步作用于NF-κB，使其表达增强并发生活化。NF-κB在炎症反应、免疫调节及细胞的凋亡、分化过程中都具有十分重要的作用[11]。其中在炎症反应中NF-κB能增加多种炎性细胞因子的表达，IL-8表达也随NF-κB表达的增多而增多，增多的IL-8又可促进NF-κB的进一步活化，从而产生炎症的级联反应，使得炎症反应被不断加强并持续作用，胃粘膜在这种不断加强又持续存在的炎症反应下反复损伤，最终朝着CAG 的方向发展。另外活化后的NF-κB从胞质转位于胞核，在细胞核内与环氧合酶-2(COX-2)的基因启动子特异性结合后使COX-2的合成增加，COX-2是(PG)前列腺素合成过程中的重要限速酶。有研究表明，COX-2蛋白高表达于癌变和癌前病变的组织中，COX-2主要通过影响前列腺素的合成调控组织的生物学行为，它能加重组织的损伤，降低机体免疫力，引起细胞的增值表达，被认为是组织发生癌变过程中的早期事件[12]。HSP70是一类内源性保护蛋白，在早期的炎症反应中即可被细胞因子诱导合成或合成增加，其抗炎作用在临床及动物实验中已被证实[13]。HSP70的高表达可以重新激活某些酶以维护细胞的功能，提高细胞对应激原的耐受性，维持粘膜的完整。HSP70通过竞争进入核孔转运的NF-κB复合体，达到抑制NF-κB活化的目的，进一步阻断炎症因子IL-8等过量产生，使IL-8与NF-κB的炎症级联放大反应被中断[14]，从而起到抗炎、减轻胃粘膜炎症损伤作用，保护胃黏膜，阻止慢性萎缩性胃炎的发生。

本研究结果提示黄芩素可能通过抑制IL-8的释放、减少NF-κB和COX-2的合成、增加HSP70的合成等环节上阻断了致病因素对胃粘膜的慢性炎症损伤，从而起到对CAG的治疗作用，并发现这种作用与黄芩素剂量密切相关，为其临床应用提供了一定的理论基础和实验依据。

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国家自然科学基金项目(No.81172135)

1.陕西中医药大学(712046)；2.陕西中医药大学第二附属医院(712000)

▲通讯作者 王小平，男，博士，教授，硕士研究生导师，主要从事肿瘤分子免疫病理学研究。E-mail:wxpphd@aliyun.com