湘江四环素及抗性基因含量特征及其季节变化

范长征等

摘要：采用高效液相色谱质谱法分析了湘江长沙河段水体及底泥中4种常见四环素类抗生素的含量特征及其季节变化，并采用实时荧光定量PCR研究了该水域相应的5种代表性抗生素抗性基因（tet A，tet C，tet G，tet M和tet X）的存在及丰度.结果表明，水体中四环素类抗生素的质量浓度均值在16.23～496.73 ng·L-1之间，底泥中四环素类抗生素的质量分数为347.77～3 829.75 ng·kg-1，易受季节变化影响.5种目标抗性基因在所有样品中均有检出，其中tet A和tet C的绝对拷贝数及相对丰度较高，为湘江长沙河段的优势抗性基因.相关性分析表明：冬季水体中的tet A和tet C含量与底泥中的含量显著相关，几种目标抗生素与抗性基因之间并不存在明显线性关系.

关键词：基因；湘江；四环素抗生素

中图分类号：X172 文献标识码：A

Abstract： This paper adopted highperformance liquid chromatographymass spectrograph （HPLCMS） to investigate the occurrence and seasonal changes of tetracycline antibiotics in the Xiang River and its sediments. Five representative antibiotic resistance genes （tet A， tet C， tet G， tet M， tet X） in water and sediment samples were quantified with realtime PCR. The concentrations of tetracycline showed sensitive seasonal changes， ranging from 16.23 ng·L-1 to 496.73 ng·L-1 in the water samples， and from 347.77 ng·kg-1 to 3 829.75 n·kg-1 in the sediment samples， respectively. The target resistance genes were detected in all samples. Compared with other resistance genes， tet A and tet C were higher in absolute copy number and relative abundance， suggesting that the tet A and tet C were dominant in the Xiang River. Statistical analysis indicated a positive correlation between the relative abundance of tet A and tet C in the water samples and the sediment samples in winter. There was no linearly relationship between antibiotics and resistance genes.

Key words： genes；the Xiang River； tetracycline

近年来，抗生素及抗生素抗性基因（Antibiotics Resistance Genes，ARGs）污染已经成为日益严峻的全球性环境问题[1-2].

四环素类抗生素具有广谱性、质优价廉等优点，是目前应用最广泛用量最大的抗生素种类之一[3].该类抗生素对革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌和衣原体等微生物发挥作用，具有广谱抗菌性和良好的治疗效果.四环素类抗生素主要包括四环素（Tetracyline，TC）、土霉素（Oxytetracycline，OTC）、金霉素（Chlortetracycline，CTC）和强力霉素（Doxycycline，DOX）等，这些抗生素不仅广泛应用于医疗，还作为兽药大量用于畜禽养殖业和水产养殖业[4].中国是四环素类抗生素生产、销售和使用的大国，年出口量高达1.34×107kg.湘江是长江七大支流之一，也是长沙市饮用水的主要来源.湘江长沙河段周边居民超过700万，周边畜禽养殖场和医疗机构密集，在医疗及养殖业中均普遍存在大量使用抗生素的问题.2009年仅长沙主城区共有72个主要排污口，每天至少将20万吨生活污水、医药废水、养殖废水和工业废水直接排入湘江及其支流，导致湘江水质不断恶化，严重影响了市民健康与经济的发展.但截至目前为止，关于湘江流域水体和底泥中抗生素及ARGs污染特征的研究还未见报道.因此，亟待开展湘江水体及底泥中抗生素含量及ARGs丰度的调查，以反映湘江抗生素及ARGs的污染现状.本研究选取了湘江长沙河段上游至下游10个采样点，分别采用高效液相色谱质谱法和实时荧光定量PCR法对湘江长沙河段流域及其支流水体和底泥中4种四环素类抗生素（TC，OTC，CTC和DOX）和5种典型ARGs（tet A，tet C，tet G，tet M和tet X）进行分析研究.此外，还探讨了ARGs和抗生素浓度之间的关系，以期为阐明中国水环境四环素类抗生素及ARGs的环境状况提供科学依据.

1材料与方法

1.1样品采集

本研究采集了湘江长沙河段及其主要支流的江水和底泥样本.从上游至下游共设10个采样点，距离城市污水处理厂、医院农业灌溉区和养鱼场等区域10～20 km，编号分别为S1～S7（湘江）和T1～T3（湘江主要支流），采样点分布如图1所示.在每个采样点及采样点上下游50 m处分别采集2.5 L距河面约0.5 m 深处的水样，100 g 河流底泥，然后将3个水样和底泥样品分别混合，水样装入棕色灭菌玻璃瓶中于4 ℃ 条件下保存，河流底泥样品装入无菌密实袋中于-18 ℃条件下保存.

1.2四环素类抗生素检测

所有水样通过0.45 μm 滤膜（Waters 公司）后，按1 000 mL水加入0.5 mg Na2EDTA，加入盐酸调pH至3.0.取经过预处理的样品提取液各10 mL经5 mL甲醇和5 mL水活化的Oasis HLB进行固相萃取富集后，依次用 5 mL水和 5 mL V甲醇∶V水=5∶95溶液淋洗.减压抽干 5 min，最后用10 mL V甲醇∶V乙酸乙酯=10∶90溶液洗脱.将洗脱液在40 ℃吹氮、浓缩至干，用1 mL标准溶液溶解残渣，过0.45 μm滤膜，供高效液相色谱质谱仪测定.

将底泥样品冷冻干燥后破碎至0.30 mm粒径，称取4 g放入锥心瓶中，加入20 mL EDTAMcllvaine缓冲溶液，振荡30 min，取上层提取液.反复提取3次，用0.45 μm滤膜过滤，其余操作同水样.

选取4种常见四环素类抗生素包括四环素（TC）、土霉素（OTC）、金霉素（CTC）和强力霉素（DOX）.依照冀秀玲等[1]报道方法，利用高效液相色谱质谱仪（Agilent 1100）检测水样及河流底泥样品中的目标抗生素含量.

1.3抗生素抗性基因（ARGs）检测

1.3.1DNA提取

采用DNA提取试剂盒（TIANGEN，Beijing）提取底泥样品及水样中的DNA.提取的DNA用1%琼脂糖凝胶电泳验证并用核酸蛋白仪检测其浓度.目的DNA条带单一，A260/280值在1.8～2.0之间，表明提取的DNA纯度较高.

1.3.2普通PCR扩增

选取16SrDNA和5种四环素类抗性基因tet A，tet C，tet G，tet M和tet X作为目的基因，抗性基因引物设计参考已发表的文献[5].PCR反应体系：DNA 1 μL，2 × Plus PCR MasterMix （TIANGEN， Beijing） 12.5 μL，下游引物（25 μM）各0.5 μL，ddH2O，10.5 μL，总体积25 μL.PCR反应程序：95 ℃ 5 min，然后95 ℃ 30 s，退火温度30 s（表1），72 ℃ 45 s，循环35次，最后72 ℃ 5 min.PCR在MyCycler thermal cycle （BioRad，America）上进行，每组目的基因扩增反应重复3次，每次设置两组无模板阴性对照.

1.3.3ARGs定量分析

对上述PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测后，割胶回收、纯化.将目的DNA片段与pGMT载体连接后，转化进入大肠杆菌DH5α感受态细胞.挑选菌落培养.使用高纯度小量质粒提取试剂盒（Bio Teke，Beijing）提取质粒.将提取的质粒用核酸蛋白质测定仪（eppendorf）检测含量及浓度.按10倍浓度梯度稀释，绘制标准曲线（r2>0.990 0）.定量PCR反应体系：DNA 1 μL，2 × SYBR realtime PCR premixture （Bio Teke，Beijing） 10 μL，下游引物（25 μM）各0.5 μL，ddH2O 8 μL，总体积20 μL.定量PCR反应程序：95 ℃ 30 s，然后95 ℃ 10 s，退火温度（表1）15 s，72 ℃ 15 s，35个循环，78 ℃ 26 s.定量PCR在iCycler IQ5 Thermocycler （BioRad，America）上进行，每组目的基因扩增反应重复3次，每次设置两组无模板阴性对照.由样本中目的基因的绝对拷贝数和内参基因16SrDNA绝对拷贝数的比值得到基因相对丰度.基因相对丰度代表的是微生物群落中所含的抗性基因数量，更能反映基因在样本中的分布情况.

2结果与讨论

2.1抗生素含量水平

表2列出了4种四环素类抗生素在湘江长沙河段水体及底泥中的含量.结果显示，无论在夏季（6月）还是冬季（12月），湘江长沙河段水体及底泥中各种四环素类抗生素（强力霉素除外）均有不同程度检出，说明湘江长沙河段流域已广泛受到四环素类抗生素的污染.底泥样品中四环素类抗生素质量分数均值为347.77～3 829.75 ng·kg-1，远高于水体中抗生素质量浓度均值16.23～496.73 ng·L-1，与之前报道的黄浦江[6]和海河[7]流域抗生素含量的检测结果类似，表明河流沉积物已经成为四环素类抗生素重要的蓄积池.沈群辉等[6]测得黄浦江底泥样品中抗生素质量浓度均值为江水中的15～130倍；Zhou等[8]在海河底泥中检测到高浓度四环素含量，Luo等[7]却发现海河水体中四环素含量低于检测下限.水体环境中四环素类药物检出率和检测水平较底泥低，可能是由于四环素类药物在土壤、黏粒，包括沉积物中都有很强的吸附性，易在河流底泥中蓄积[9].本研究中，湘江长沙河段水体及底泥中四环素和土霉素的检出率达到100%，远高于其他国家和地区的检出率[10-11]，这在一定程度上反映了湘江长沙河段周边区域四环素类抗生素的大量使用和排放.从表2可以看出，湘江长沙河段水体中冬季的四环素类抗生素质量浓度明显高于夏季.12月水体中的四环素平均质量浓度为412.65 ng·L-1，约为6月份的25倍；12月水体中土霉素质量浓度均值为496.73 ng·L-1，约为6月的16倍；12月水体中金霉素平均质量浓度为23.55 ng·L-1，但是6月水体中没有检测到金霉素.湘江长沙河段冬季水体中四环素类抗生素含量明显高于夏季，可能是由以下几个原因引起：一是冬季是湘江的枯水期，江水水量小，流速慢，抗生素被水流稀释的速率减慢导致水体中抗生素浓度增大；二是冬季是感冒等疾病的多发季节，人畜抗生素用量也随之加大，导致排入环境中的抗生素量大大增加；三是冬季温度较低时，微生物的增殖活动和新陈代谢减缓，对环境中抗生素的吸附、转移和降解能力减弱.Yang等[12]研究了珠江水体和沉积物中抗生素的空间及季节变化规律，Kim S C等[13]研究了美国科罗拉多州北部科林斯堡河沿线5个不同功能区的水体和沉积物中15种抗生素的变化规律，结果均显示水体中抗生素的含量水平受季节变化影响大，冬季水体中抗生素含量和检出率明显高于夏季，但底泥中抗生素含量水平受季节变化影响不大.

2.2抗性基因定量PCR结果

图2为水样及底泥样本中16SrDNA和5种目标ARGs（tet A，tet C，tet G，tet M，tet X）的丰度.

通过PCR研究发现湘江长沙河段底泥中微生物浓度远高于水体中的浓度，水体和底泥中的16SrDNA丰度均受到季节变化影响，6月测得的16SrDNA丰度约为12月的15倍.夏季较高的水体温度、营养利用率以及较低水平的抗生素含量都会促进微生物生长繁殖，因此夏季环境中16SrDNA丰度提高.本研究在所有的样品中均检测到目的抗性基因tet A，tet C，tet G，tet M和tet X，其中tet A和tet C在样本中的相对丰度较高，为湘江长沙河段的优势抗性基因（图3）.水体和底泥中tet A与内参基因16SrDNA的比值分别为1.5×10-3～6.7×10-3和1.0×10-4～1.3×10-4，tet C在江水和底泥中与内参基因16SrDNA的比值为2.1×10-3～7.3×10-3和8.2×10-5～1.9×10-4，其相对丰度与国外污水处理系统中的基因丰度相当[14].

杨颖等[15]调查了北江流域四环素抗性基因的污染情况，发现在所检出的四环素抗性基因中，含量最高的是tet C，与16SrDNA拷贝数比值范围在8.3×10-2～13.20之间，其次是tet A.但是Hu Y等[16]检测了从北京文峪河流域分离得到的大肠杆菌中20种四环素类抗生素抗性基因，结果表明抗性基因tet A，tet B，tet M的含量占到了90%，tet C含量水平却很低.不同地区呈现出的不同ARGs污染特征，可能与当地抗生素的施用、残留的环境选择压力密切相关.此外，还发现，冬季河流流速较缓慢的情况下，湘江长沙河段水体中的优势抗性基因tet A和tet C与底泥中的tet A和tet C含量显著相关（图4），表明湘江水体和底泥中的ARGs处在动态平衡中，即使在相对静态的环境中，水体中的抗药菌和ARGs也会向底泥迁移，同理，底泥中的抗药菌和ARGs也会向水体中迁移[17].研究还发现，支流水体中tet A和tet C的丰度普遍高于主干流（表3），这个结果是符合实际情况的.农田灌溉废水、畜牧养殖污水、城市污水直接排入江河支流，使支流成为ARGs形成和传播扩散的重要场所，也使支流成为直接向江河干流输送ARGs的源头.Luo等[7]测得中国海河流域支流中的Sul 1，Sul 2和磺胺类抗生素的含量远高于主干流，Pruden A等[18]对美国科林斯堡河流域进行调查也有类似发现.

2.3四环素类抗生素与ARGs相关性分析

夏季由于强烈的光解作用、生物降解和快速的水体流动，使得环境中抗生素浓度相对较低.本研究中，夏季水体中四环素类抗生素的总浓度均值为47.90 ng·L-1，而冬季水体中则为932.93 ng·L-1；夏季底泥中四环素类抗生素的总浓度均值为2 777.98 ng·kg-1，而冬季底泥中则为6 756.06 ng·kg-1.夏季环境中抗生素质量浓度低可能导致ARGs相对丰度较低.理论上讲，作为ARGs的直接

选择因素，环境中诱导抗生素的含量水平会直接影响ARGs的相对丰度[19].但是，本研究对四环素类抗生素浓度与抗性基因相对丰度进行相关性分析，结果显示几种目标抗生素与抗性基因之间并不存在明显线性关系（结果未列出）.已有研究显示，除诱导抗生素含量水平外，ARGs丰度还可能受环境因子及其他污染物等因素的影响，如微生物生长速率、转运子、供氧条件、光照条件、温度变化、重金属和pH等.Rysz等[20]发现抗性基因在有利于微生物新陈代谢的环境中更容易保存下来，大肠杆菌在厌氧条件下更容易丢失抗性基因.Engemann等[17]比较了光照和黑暗条件下畜牧业污水中四环素类抗性基因的迁移和衰减情况，表明光照会促进ARGs的降解，并且不同的抗性基因受到光照影响的程度不相同.Pei R等[19]在研究中发现厌氧处理和高温条件有利于降低水体中ARGs的含量水平.大量报道表明，环境中的重金属污染对抗生素抗性的保持和增殖有重要作用，重金属可与抗生素形成协同抗性，使微生物群落产生多重抗性，从而导致环境中ARGs丰度升高[21].目前，在自然环境中已分离得到多株具有抗生素和金属离子双重抗性的细菌.Sinha等[22]从印度德里污水处理厂水体中分离得到的大肠杆菌（Escherichia coli）、假单胞菌（Pseudomonas）、芽孢杆菌（Bacillus）和金黄色葡萄球菌（staphylococcus aureus）既有对锌、铅、镉等重金属的抗性，也有对四环素的抗性.湘江长沙河段水体和底泥中重金属复合污染严重，镉、铅、砷含量严重超标[23-25]，这些因素可能会对抗生素抗性基因的形成、水平转移和扩增起到积极作用，从而加剧湘江流域的ARGs污染.

3结论

1）湘江长沙河段水体及底泥已经广泛受到四环素类抗生素的污染，本研究所检测的4种四环素类抗生素（强力霉素除外）在所有样品中均有检出，说明湘江长沙河段周边区域四环素类抗生素滥用情况相当严重.底泥中四环素类抗生素含量水平总体要高于水体，这可能与四环素类抗生素与粘土有较强的吸附性有关.数据还表明，水体中抗生素含量水平易受季节变化影响，冬季水体中抗生素含量明显高于夏季.

2）湘江长沙河段水体及底泥中，5种目的抗性基因均有检出，tet A和tet C相对丰度最高，为水域中的优势抗性基因.研究还发现冬季水体与底泥中的tet A和tet C含量显著相关，表明湘江水体和底泥中的ARGs处在动态平衡中.

3）水体及底泥中ARGs与抗生素相关性分析显示，目标抗生素与抗性基因之间并不存在明显的线性关系，说明ARGs丰度不仅仅受导抗生素含量影响.

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