ER C-erbB-2和CyclinB1在人乳腺癌中的表达及其相关性研究

唐加步，曹 军，姚运红，曾 超（.广东医学院东莞校区病理学教研室，广东东莞53808；.广东医学院附属医院病理科，广东湛江54000）

ER C-erbB-2和CyclinB1在人乳腺癌中的表达及其相关性研究

唐加步1，曹 军2，姚运红1，曾 超1
（1.广东医学院东莞校区病理学教研室，广东东莞523808；2.广东医学院附属医院病理科，广东湛江524000）

目的探讨雌激素受体（ER）、细胞原癌基因C-erbB-2和细胞周期蛋白B1（CyclinB1）在乳腺癌组织中的表达及其临床意义。方法采用免疫组化SP法检测2010～2013年接受乳腺癌根治术的70例患者乳腺癌组织中ER、C-erbB-2和CyclinB1的表达，观察其与淋巴结转移及乳腺癌病理类型、肿瘤大小、组织分级等的关系。结果乳腺癌组织中ER的表达与淋巴结转移呈负相关（r=-0.329，P＜0.01），C-erbB-2、CyclinB1的表达与淋巴结转移呈正相关（r=0.467、0.548，P＜0.01），CyclinB1的表达与组织分级和肿瘤大小呈显著相关 （r=0.589、0.568，P＜0.01）；ER和C-erbB-2的表达与病理类型、肿瘤大小、组织分级等均无相关性（P＞0.05）；CyclinB1的表达与病理类型无相关性（P＞0.05）。乳腺癌组织中ER与C-erbB-2、CyclinB1的表达呈显著负相关（r=-0.402、-0.376，P＜0.01）。结论联合检测乳腺癌组织中ER、C-erbB-2和CyclinB1的表达有助于乳腺癌预后的判断，对指导治疗和提高疗效有重要意义。

免疫组织化学； 乳腺肿瘤； 受体，雌激素； 基因，erbB-2； 细胞周期蛋白类； 基因表达； 淋巴转移

乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一，近年来其发病年龄趋向年轻化，且发病率不断上升。雌激素受体（ER）及相关肿瘤基因的表达与乳腺癌关系密切。本研究采用免疫组织化学（免疫组化）方法检测70例乳腺癌组织中ER、细胞原癌基因C-erbB-2和细胞周期蛋白B1（CyclinB1）的表达，旨在讨论三者与乳腺癌生物学行为的关系及其临床意义。

1 资料与方法

1.1 资料

1.1.1 一般资料 本组70例乳腺癌患者均于2012～2013年接受乳腺癌根治术，所有病例标本均来自广东医学院附属医院病理科，均按WHO乳腺肿瘤的组织类型分类，患者年龄16～67岁。所有患者术前未经任何抗癌治疗，病理资料完整。标本经10%甲醛液固定，石蜡包埋。4 μm连续切片，每个蜡块均有苏木精-伊红（HE）染色对照片。

1.1.2 试剂 ER、C-erbB-2基因单克隆抗体、CyclinB1、二氨基联苯胺（DAB）显色试剂盒及SP试剂盒均为即用型（北京中杉金桥生物技术有限公司生产）。粘片剂氨醛酸乙基硅（APES）由武汉博士德生物工程有限公司提供。

1.2 方法

1.2.1 观察指标 观察乳腺癌组织中ER、C-erbB-2和CyclinB1的表达及其与淋巴结转移及乳腺癌病理类型、肿瘤大小、组织分级等病理指标的关系。

1.2.2 免疫组化方法 用磷酸盐缓冲液（PBS）代替一抗作阴性对照；用不加一抗的切片作阴性对照，已知阳性切片作阳性对照。（1）ER免疫组化SP法操作步骤：将APES与丙酮按1∶50稀释，然后涂于清洁的载玻片上，使其自然干燥。将石蜡组织制成4 μm厚切片，取片后放置于58～60℃烤箱中30～60 min，使切片紧密黏附，常规脱蜡、水洗；3%过氧化氢（H2O2）孵育5 min，消除内源性过氧化物酶；PBS水洗，每次1 min，洗3次；置于0.01 mol/L枸橼酸缓冲液中加热至90～100℃10 min使抗原修复，自然冷却后PBS水洗，每次1 min，洗3次；然后用山羊血清保护抗原孵育10 min；倾去血清，滴加一抗[1∶5稀释的抗ER和孕激素受体（PR）的单抗]，置于4℃冰箱过夜；PBS水洗，每次3 min，洗3次，滴加二抗工作液，室温孵育30 min；PBS水洗，每次3 min，洗3次，滴加辣根过氧化物酶标记的链激酶卵白素工作液，室温孵育30 min；PBS水洗，每次3 min，洗3次，DAB显色，镜下监视至细胞着色；自来水充分水洗，苏木素复染，封片。（2）CyclinB1、C-erbB-2免疫组化SP法操作步骤：将APES与丙酮按1∶50稀释，涂至清洁载玻片上，自然干燥；将石蜡组织制成4 μm厚切片，捞片后置烤箱58～60℃30～60 min，使切片紧密黏附，常规脱蜡水洗；蒸馏水新鲜制备3%H2O2，室温孵育5～10 min，灭活内源性酶，蒸馏水水洗，每次 1 min，洗3次；微波修复抗原：将切片浸入0.01 mol/L柠檬酸盐缓冲液（pH 6.0）中，置于微波炉内加热至96～100℃，持续20 min，冷却至室温，滴加抗原修复液，室温放置10 min，蒸馏水水洗，每次1 min，洗3次；加正常工作血清封闭液50 μL，室温放置10 min，甩去多余液体，不洗，加一抗（1∶50稀释的抗CyclinB1和C-erbB-2单抗50 μL），置4℃冰箱过夜，用PBS水洗，每次1 min，洗3次；加生物素化山羊抗小鼠IgG50μL，室温放置20min，PBS水洗，每次1min，洗3次；加HIGH-SABC（高敏感性链霉素亲和素-生物素-过氧化物酶）50 μL，室温放置20 min，PBS水洗，每次3 min，洗3次；DAB显色，室温放置20 min，镜下控制反应时间，自来水终止显色，HE轻度复染、脱水、透明、封片。

1.2.3 乳腺癌组织中ER、C-erbB-2、CyclinB1阳性表达判定标准 乳腺癌组织中ER阳性物质定位于细胞核，阳性反应为核内出现棕褐色颗粒；CyclinB1阳性物质定位于细胞核，阳性反应为核内出现棕褐色颗粒；C-erbB-2基因定位于细胞膜，阳性反应为细胞膜上出现棕黄色颗粒。分别由2名有经验的病理医生采用双盲法观察至少5个具有代表性的高倍视野（400×），不少于1 000个细胞，染色细胞数超过10%者判断为ER、C-erbB-2、CyclinB1表达阳性，否则为表达阴性。

1.3 统计学处理 应用SPSS19.0统计软件进行数据分析，采用χ2检验和Spearman相关分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

图1 ER在乳腺癌组织中的表达（SP法，400×）

图2 CyclinB1在乳腺癌组织中的表达（SP法，400×）

图3 C-erbB-2在乳腺癌组织中的表达（SP法，400×）

表1 乳腺癌组织中ER、C-erbB-2、CyclinB1表达与临床病理指标的关系（n）

2.1 乳腺癌组织中ER、C-erbB-2、CyclinB1阳性表达结果 3种基因在乳腺癌组织中的表达见图1～3。

2.2 乳腺癌组织中ER、C-erbB-2、CyclinB1表达与临床病理指标的关系 表1结果显示，ER、C-erbB-2及CyclinB1的表达与淋巴结转移比较，差异有统计学意义（χ2=7.565、15.260、20.992，P＜0.05），乳腺癌组织中ER的表达与淋巴结转移呈负相关（r=-0.329，P＜0.01），而C-erbB-2、CyclinB1的表达与淋巴结转移呈正相关（r= 0.467、0.548，P＜0.01）。CyclinB1的表达与组织分级和肿瘤大小呈显著正相关（r=0.589、0.568，P＜0.01），差异有统计学意义（χ2=4.306、22.607，P＜0.01）而与病理类型无相关性（P＞0.05）。ER和C-erbB-2的表达与病理类型、肿瘤大小、组织分级等均无相关性（P＞0.05）。

2.3 乳腺癌组织中ER与C-erbB-2、CyclinB1表达的关系 70例乳腺癌组织中ER与C-erbB-2、CyclinB1表达呈显著负相关（r=-0.402、-0.376，P＜0.01），见表2。

表2 乳腺癌组织中ER与C-erbB-2、CyclinB1表达的关系（n）

3 讨 论

乳腺癌是一种雌激素依赖性肿瘤，近年来关于ER在乳腺癌中的作用研究较多。有研究表明，乳腺癌患者预后的判断、治疗及其生物学行为均与ER存在一定关系[1-2]。ER是一种有特定功能的蛋白质，能调节乳腺癌细胞的分化和生长，但在细胞癌变过程中，其成分随着细胞分化程度高低而受到较大影响，因低分化而出现丢失或部分丢失。内分泌治疗对ER阳性患者效果较好，临床上运用较多。本研究结果显示，ER的表达与淋巴结转移呈负相关（r=-0.329，P＜0.01）。提示ER表达阴性的淋巴结可能会出现转移、肿瘤恶性程度高、预后不良。因此，对于ER阴性的患者，即便是未见淋巴结转移，也应当重视其术后的综合治疗。但本研究未发现ER的表达与病理类型、肿瘤大小、组织分级有关，与崔洁等[3]的研究结果一致。

细胞原癌基因C-erbB-2位于人体第17号染色体q21带上，具有酪氨酸激酶活性，参与正常细胞的生长、分化和分裂，当受到体内外某些因素作用后可被激活，从而具有肿瘤转化活性[4-5]。在人类乳腺癌病变和发展过程中，其主要的激活方式是基因扩增，促进癌细胞运动加速，从而导致癌瘤深部浸润及转移。大多数学者认为，C-erbB-2在乳腺癌中的表达与组织分级、基因蛋白、淋巴结转移有关。C-erbB-2与其他预后因子相比更有价值，被认为是第2位且有预后意义的指标，与ER的表达呈显著负相关[6]。本研究结果显示，C-erbB-2与淋巴结转移呈正相关（r=0.476，P＜0.01），支持其作为乳腺癌判断预后重要指标的结论。C-erbB-2与ER表达呈显著负相关，对乳腺癌ER、PR阳性者进行内分泌治疗效果良好，预后较好；如C-erbB-2表达水平过高，说明癌基因被激活，癌细胞分化减弱，甚至停滞，同时，乳腺癌依赖激素生长的特性也相应受到抑制，内分泌治疗因癌细胞分化降低而使效果较差或无效果[7]。本研究70例乳腺癌组织中C-erbB-2的阳性表达率为65.7%（46/70），高于国外文献报道[8]，与国内学者报道乳腺癌中C-erbB-2基因的过度表达率为9.0%～66.0%（平均19.5%）相符[9]，这是否与种族和地理环境有关值得进一步探讨。

有研究表明，参与乳腺癌发病机制的学说有多种，但诸多学者认为多与某些因子的异常表达有关，而这种基因是由多种细胞周期调控因子的异常表达所导致的[10-11]。CyclinB1的过度表达与乳腺癌细胞的有丝分裂指数和增殖指数有关[12-13]，而过表达的CyclinB1对G2/M调控产生干预，促进了细胞的异常分裂和增殖。本研究也发现，乳腺癌细胞中存在CyclinB1的过表达，且与淋巴结转移呈正相关（r=0.548，P＜0.01），与组织分级和肿瘤大小呈显著正相关（r=0.589、0.568，P＜0.01）。肿瘤越大、病程越晚期、淋巴结转移数目越多则CyclinB1的阳性表达越高。由此可见，CyclinB1的过表达与肿瘤转移和低分化密切相关，是乳腺组织发生恶性转化的重要因素，说明CyclinB1可作为判断乳腺癌细胞分裂、增殖能力的有效指标，并有助于判断患者的预后。

综上所述，乳腺癌组织中ER和C-erbB-2、CyclinB1表达的相关性研究显示，对乳腺癌患者进行ER、C-erbB-2和CyclinB1联合检测有助于乳腺癌预后的判断，对指导临床治疗和提高疗效具有重要意义。

[1]Helin HJ，Helle MJ，Kallioniemi OP，et al.Immunohistochemical determination of estrogen and progesterone receptors in human breast carcinoma. Correlation with histopathology and DNA flow cytometry[J].Cancer，1989，63（9）：1761-1767.

[2]Mercer RJ，Bryan RM，Bennett RC.Hormone receptors in male breast cancer[J].Aust NZ J Surg，1984，54（3）：215-218.

[3]崔洁，刘新兰，陈萍.乳腺癌组织中雌、孕激素受体及C-erbB-2基因的表达与预后关系的探讨[J].宁夏医学杂志，2008，30（10）：868-870.

[4]Hudson LG，Ertl AP，Gill GN.Struture and inducible regulation of the human C-erbB-2/nue promoter[J].J Biol Chem，1990，265（8）：4389-4393.

[5]Hynes NE，Stern DF.The biology of erbB-2/neu/HER-2 and its role in cancer[J].Biochim Biophys Acta，1994，1198（2/3）：165-184.

[6]Moriki T，Takahashi T，Hiroi M，et al.Histological grade in invasive ductal carcinoma of breast correlates with the proliferative activity evaluated by BrdU：an immunohistochemical study including correlations with p53，c-erbB-2 and estrogen receptor status[J].Pathol Int，1966，46（6）：417-425.

[7]许炳基，倪灿荣，范淼.乳腺癌中nm23与C-erbB-2、ER、PR的表达及预后相关性研究[J].诊断病理学杂志，1999，6（3）：171.

[8]Morales L，Reigosa A，Caleiras E，et al.HER2/neu expression in Venezuelan patients with locally advanced breast cancer[J].Invest Clin，2008，49（1）：69-78.

[9]胡勇，饶慧蓉，吴强.癌基因C-erbB-2、抗癌基因p53在乳腺癌中表达的临床病理研究[J].临床与实验病理学杂志，1995，11（1）：6-10.

[10]Chae SW，Sohn JH，Kim DH，et al．Overexpressions of cyclin B1，cdc2，p16 and p53 in human breast cancer：the clinicopathologic correlations and prognostic implications[J]．Yonsei Med J，2011，52（3）：445-453．

[11]Kim MK，Kang YJ，Kim DH，et al．A novel hydroxamic acid derivative，MHY218，induces apoptosis and cell cycle arrest through downregulation of NF-κB in HCT116 human colon cancer cells[J]．Int J Oncol，2014，44（1）：256-264．

[12]Collecchi P，Santoni T，Gnesi E，et al.Cyclins of phases G1，S and G2/M are overexpressed in aneuploid mammary carcinomas[J].Cytometry，2000，42（4）：254-260.

[13]Megha T，Lazzi S，Ferrari F，et al.Expression of the G2/M checkpoint regulators CyclinB1 And P34CDC2 in breast cancer：a correlation with cellular kinetics[J].Anticancer Res，1999，19（1A）：163-169.

Expressions of estrogen receptor，C-erbB-2 and CyclinB1 in breast carcinoma and their correlation

Tang Jiabu1，Cao Jun2，Yao Yunhong1，Zeng Chao1
（1.Teaching and Researching Section of Pathology，Dongguan Campus of Guangdong Medical College，Dongguan，Guangdong 523808，China；2.Department of Pathology，Affiliated Hospital，Guangdong Medical College，Dongguan，Guangdong 524000，China）

ObjectiveTo study the expressions of estrogen receptor（ER），C-erbB-2 and CyclinB1 in breast carcinoma tissues and their correlations.MethodsThe immunohistochemical SP method was adopted to detect the expressions of ER，C-erB-2 and CyclinB1 in the samples of breast carcinoma tissue from 70 patients receiving breast cancer radical operation during 2010-2013.Their relation with the lymph node metastasis，breast cancer pathological types，tumor size and histological grade was observed.ResultsThe ER expression in breastcancer had a negative correlation with lymph node metastasis（r=-0.329，P＜0.01）.The positive correlation was found between lymph node metastasis with expressions of C-erbB-2 and CyclinB1（r=0.467，0.548，P＜0.01）. Moreover，the CyclinB1 expression was significantly correlated with the histological type and tumor size（r=0.589，0.568，P＜0.01）；the expression of ER and C-erbB-2 had no correlated with the pathological types，tumor size and histological types（P＞0.05）；no correlation was found between the CyclinB1 expression and the pathological types（P＞0.05）.The ER expression had a significantly negative correlation with expressions of C-erbB-2 and CyclinB1 in breast cancer tissues（r=-0.402，-0.376，P＜0.01）.ConclusionThe combined detection of ER，C-erbB-2 and CyclinB1 in breast cancer tissues is conducive to the judgment of breast cancer prognosis and has an important significance to guide the treatment and increase the curative effect.

Immunohistochemistry； Breast neoplasms； Receptors，estrogen； Genes，erbB-2； Cyclins； Gene expression； Lymphatic metastasis

10.3969/j.issn.1009-5519.2015.18.002

A

1009-5519（2015）18-2730-03

2015-06-02）

唐加步（1974-），男，广东化州人，讲师，主要从事肿瘤病理学教学与研究工作；E-mail：zjtangjb08@hotmail.com。