2株依赖海水细菌的分离培养和鉴定

余中华等

摘 要 为提高海洋微生物的可培养性，采用海水需求实验分离海洋细菌的方法，分离出9株严格依赖海水生长的细菌。通过16S rDNA测序及同源性分析发现：菌株HB10001（=CGMCC 1.10781T）与Spongiibacter tropicus DSM19543T的16S rDNA序列同源性最高，为96.3%，其（G+C）含量为66.7 mol%；菌株HB10303与Paenibacillus. agaridevorans DSM1355T的16S rDNA序列同源性最高，为98.4%，其（G+C）含量为45.5 mol%。

关键词 依赖海水；细菌；分离培养

分类号 Q933

Isolation and Characterization of Seawater Required Bacteria

YU Zhonghua1，2） LIU Jiayang1） CHEN Fujia1） BAO Shixiang2）

（1 Huanghuai University， Zhengzhou， Henan 450000， China

2 Institute of Tropical Biosciences and Biotechnolog Key Laboratory of Ministry

of Agriculture for Tropical Biotechnology， CATAS， Haikou， Hainan 571101， China）

Abstract In order to increase the cultivability of seawater-required bacteria， 9 strains were isolated for their seawater requirements. strain HB10001（=CGMCC 1.10781T） had the highest sequence similarity with Spongiibacter tropicus DSM19543T（96.3%）. The G+C content is 66.7 mol%. Strain HB10303 had the highest sequence similarity with Paenibacillus agaridevorans DSM1355T（98.4%）. The G+C content is 45.5 mol%.

Keywords seawater required ； bacteria ； isolation

海洋微生物对海水中盐的组分和浓度有不同程度的依赖性，因此，在设计培养基时，需要考虑海盐对海洋微生物生长的影响[1]。有些海洋微生物的培养离不开海水，所以在培养基中添加海水是必不可少的。Mincer[2]发现的海孢菌Marinospora spp.和盐孢菌Salinispora spp.只能在海水配制的培养基上生长。Han等[3]从阿穆尔斯基海湾中分离到的Salinibacterium amurskyense gen. nov. sp. nov是Microbacteriaceae的一个新属。这类菌株能耐受浓度高达10%的NaCl，不过NaCl对其生长则并非必需，说明该菌株对海洋环境有良好的适应性。Tsueng等[4]对海水中的阳离子及离子强度对Salinispora的3个种S. pacifica，S. arenicola和S. tropica生长的影响进行了初步研究，结果表明，钙离子和二价镁离子及某些特定的离子强度对于Salinispora spp.的生长是必需的。Zhang等[5]采用5种不同培养基，分别对5种海绵中可培养放线菌进行分离，证明培养基对可培养微生物的数量有显著影响；其中，在无机盐成分最为丰富的M3培养基上分离到的菌群也具有最大的多样性。

本研究针对海洋细菌的特殊生存进化环境，通过在R2A寡营养培养基中添加海水、纯水及NaCl溶液模拟海洋环境，提高海洋微生物的可培养性，最大程度地分离培养依赖海水的细菌，并分离出新的未培养细菌。同时，利用多相分类方法对分离出来的细菌进行系统分类和鉴定，探明它们的种属特性和系统发育学地位，进一步丰富海洋微生物资源库，以期为后期新基因、新化合物研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 海洋细菌分离培养基

R2A培养基（海水）：0.05 g细菌学蛋白胨，0.05 g酵母粉，0.05 g可溶性淀粉，0.05 g葡萄糖，0.05 g酸水解酪素，0.03 g丙酮酸钠，1.5 g琼脂粉，100 mL海水，pH 6.8。

R2A培养基（纯水）：0.05 g细菌学蛋白胨，0.05 g酵母粉，0.05 g可溶性淀粉，0.05 g葡萄糖，0.05 g 酸水解酪素，0.03 g丙酮酸钠，1.5 g琼脂粉，100 mL纯水，pH 6.8。

R2A培养基（NaCl）：0.05 g细菌学蛋白胨，0.05 g酵母粉，0.05 g可溶性淀粉，0.05 g葡萄糖，0.05 g 酸水解酪素，0.03 g丙酮酸钠，1.5 g琼脂粉，100 mL 2%NaCl溶液，pH 6.8。

1.1.2 待测菌株

HB10001，HB10303分离自海南省三亚市三亚湾海水和海南省昌江县海泥（表1）。

1.2 方法

1.2.1 海水、海绵、海泥样品采集

于2011年9～10月分别在海南省和广东省采集样品用于海洋微生物分离。样品信息详见表1。

1.2.2 依赖海水细菌的分离方法

将采回的海绵、海底沉积泥样品加入一定比例的无菌海水，匀浆后，备用。配制R2A海水和R2A纯水平板培养基。将处理好的样品稀释至10-3涂布在R2A海水平板上，培养7 d后，首先进行菌落形态和菌落个数统计，然后将R2A海水平板上长出的可见菌落挑出在新的R2A海水平板培养基上重新划线培养，以获得纯菌株。再将获得的纯菌株进行进一步的海水需求试验。

1.2.3 海水需求试验

纯化后的细菌测定步骤：用灭菌接种环从R2A（海水）培养基上挑取一定量的菌落，分别接种于R2A（纯水），R2A（海水）以及R2A（NaCl）3种培养基中培养1～4周。采用显微镜观察其生长情况。如果只在海水R2A培养基中观察到菌落生长，则说明其需要海水才能正常生长。

统计R2A（纯水），R2A（海水）以及R2A（NaCl）平板培养基分离海水、海绵样品的菌落数；统计海水需求试验结果，记录严格依赖海水和不需要依赖海水的菌株数，并统计其在总体分离细菌中所占比例。将严格需求海水的细菌作为目标菌，进行下一步测序研究。

1.2.4 培养特征分析

采用R2A（海水）培养基，将纯化的于对数生长期的成熟菌株HB10001，重新接种在R2A（海水）培养基上，于25℃温箱中培养7～14 d，并观察记录菌落形态、大小、干湿情况、颜色特征和生长状况等。

1.2.5 显微形态特征分析

将接种纯化后的待测菌培养7～14 d后，选取生长较好的菌落，用灭菌接种环将菌落挑取到无菌离心管中，冷冻干燥。再将冻干呈粉状的待测菌贴于有导电胶带的电镜样品底座上，镀膜处理（纯金膜）。最后采用扫描电镜观察，并选取较好的待测菌密度以及清晰的视野进行拍照保存。

1.2.6 生理特征分析

均参考Smibert和Krieg[6]的方法，包括革兰氏染色，菌株运动性试验，耐盐范围，生长pH值范围，生长温度范围。

1.2.7 分子分类研究

总DNA提取、16S rDNA基因扩增与系统发育分析：采用Saito和Miura[7]报道的方法提取和纯化细菌DNA。PCR扩增条件：93℃、预变性2 min；再于93℃变性30 s，52℃退火60 s，72℃延伸2 min，共35个循环：72℃ 延伸10 min。采用1%琼脂糖凝胶对PCR产物电泳检测。将PCR扩增产物交给上海生工工程有限公司测序后，获得的菌株16S rDNA序列，通过GenBank中的Blast程序与核酸数据进行对比，分析得出相似性（http：//ncbi.nlm.nih.gov/blast）[8]。选取系统中比对结果相似性高的菌株及其序列，采用Clustal X2.0软件包进行多序列匹配排列，Mega3.1软件包中的Kimura-parameter 方法计算进化距离，neighbor-joining[9]方法构建系统发育树，100次随机抽样，以自引导值（Bootstrap）评估系统发育树的置信度[10]。

（G+C）mol%含量的测定：采用Mesbah报道的方法，用高效液相色谱分析基因组DNA（G+C）mol%[11]。

2 结果与分析

2.1 依赖海水细菌的分离培养

2.1.1 菌落计数

在稀释梯度为10-3的情况下，通过平板计数发现，R2A海水培养基，无论是在菌落形态多样性上，还是菌落个数的统计上，都较其他2种培养基更优（图1，表2）。结果表明，R2A海水培养基上的菌落直径在0.2～2 mm，形状以圆形为主，边缘规则，颜色以白色和透明无色为主，有黄色，蓝色和绿色的菌落。

2.1.2 海水需求实验

结果表明，经过划线纯化后的267株细菌中，有9株严格依赖海水的细菌（图2），编号分别为：HB09009，HB09010，HB09012，HB10001，HB10301，HB10302，HB10303，HB10304，HB10305。观察菌株HB10001、HB10303在海水、纯水及NaCl 3种R2A培养基上的生长状况发现：HB10001、HB10303在最适温度25℃下，经过1～4周培养，HB10001在纯水及2% NaCl的R2A培养基上无生长，只在海水R2A培养基上生长，且生长状况良好；HB10303仅能在海水R2A培养基上生长，且生长状况不好，说明培养基有待进一步优化。

2.2 菌株HB10001和HB10303的鉴定

2.2.1 培养特征分析

菌株HB10001培养特征：生长缓慢，在R2A固体培养基平板上划线培养6 d左右可见菌落，培养10 d左右可见成熟、清晰的菌落形态为扁平的圆形小菌落，菌落直径为0.1～0.3 mm；菌落成乳黄色、半透明、表面光滑、边沿不规则，无基内菌丝。

菌株HB10303培养特征：生长缓慢，在R2A固体培养基划线培养10～15 d可见菌落，培养20 d以上可见成熟、清晰的菌落形态为扁平的圆形小菌落，直径为0.5 mm；菌落呈白色半透明状，表面光滑，边沿规则，无基内菌丝 。

2.2.2 显微形态特征分析

菌株HB10001显微形态特征：两头尖的长杆状，不产生孢子，无鞭毛。大小范围：长径为100～300 μm，短径为10 μm。

菌株HB10303显微形态特征：长杆状。大小范围：短径0.5～1.4 μm，长径2～8 μm（图3）。

2.3 生理特征

菌株HB10001为革兰氏阴性细菌，无运动性。在海水存在的情况下，能在0～4% NaCl范围内生长，最适为3%。能在pH值5.5～7.5的范围内生长，最适pH 6.8。能在温度为8～38℃的范围内生长，最适生长温度为25～38℃。

菌株HB10303为革兰氏阴性细菌，无运动性。在海水存在的情况下，能在0～3% NaCl范围内生长，最适为1%。能在pH值5.5～7.5的范围内生长，最适pH 7.2。能在温度为8～45℃的范围内生长，最适生长温度为15℃。

2.4 分子指征分析

2.4.1 基因组DNA（G+C）mol%含量

对2株新分离的菌落进行（G+C）mol%含量分析发现，菌株HB10001的（G+C）mol%为66.7%，菌株HB10303的（G+C）mol%为45.5%。

2.4.2 16S rDNA序列测定及系统发育分析

菌株HB10001和菌株HB10303 16S rDNA序列全长分别为1 424 、1459 bp，将16S rDNA序列拼接后的结果与EzTaxon server（http：//www.eztaxon.org/）（Chun et al.，2007）中相关菌进行Blast比对，并将该结果在Genbank数据库中进行登陆注册，菌株HB10001的登录号为HM068370。参照序列比对后的结果，选取同源性高的标准菌株，利用ClustalX（Version1.8）软件进行排序，选用Mega 3.1软件中的neighbor-joining方法构建系统发育树（图4、5）

3 讨论与结论

现今有关真正的海洋微生物的定义仍有争论，普遍认为，分离自海洋环境，正常生长需要海水，并可在寡营养、低温条件下生长的微生物可视为严格的海洋微生物。然而，有些分离自海洋的微生物，其生长不一定需要海水，只需要加入适当的盐离子，就可产生不同于陆栖微生物的代谢产物，或者拥有某些特殊的生理性质，也被视为海洋微生物。与陆栖细菌相比，海洋细菌普遍耐盐，最适盐度在2%～4%，也可以利用海洋微生物的特殊耐盐度筛选真正的海洋细菌。本研究采用的分离依赖海水细菌的方法，是用于筛选出严格需求海水的细菌。此类细菌在普通的淡水寡营养培养基或者加入一定量Na+的情况下，都不能正常生长。本研究发现，在传统的寡营养培养基中，添加海水可提高海洋微生物的可培养性。所获得的9株菌则是常规传统培养基分离所忽略的类群。

细菌的多相分类研究经历了长期不断的发展和提高。早期主要以形态特征、培养特征及生理生化特征等分类学特征对其进行描述分类。但传统分类系统不能确切说明遗传进化地位和关系。现今分子生物学技术在现代分类学中已占主导地位。一般认为，16S rDNA 序列同源性大于95%的菌可归为同一属，大于97% 可视为同一种。因此，在菌株鉴定时，16S rDNA 序列同源性低于 95%的菌可考虑建立新属，低于 97% 的建立新种时必须测定DNA-DNA 杂交率。本实验得到的菌株HB10001，与其16S rDNA序列同源性最高的是Spongiibacter tropicus DSM19543T（96.3%），因此需要测定 DNA-DNA 杂交率来确定是否为新种。HB10303与Paenibacillus. agaridevorans DSM1355T（98.4%）的16S rDNA序列同源性最高，则需要通过进一步的多相分类来鉴定。

同时，菌株HB10001、HB10303分离自中国南海，都只能在海水培养基中形成正常的菌落，离开海水，均不能生长。此外，通过耐盐试验发现，HB10001耐盐范围为0～4%，HB10303耐盐范围为0～3%。综合菌株来源、低温适应性、菌株严格依赖海水生长、盐耐受性，认为菌株HB10001，HB10303为海洋细菌。

参考文献

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