碳纳米材料在聚合酶链式反应中的研究进展

2015-07-17国家知识产权局专利局专利审查协作广东中心广州510530

山东工业技术 2015年7期

贾静（国家知识产权局专利局专利审查协作广东中心,广州510530）

碳纳米材料在聚合酶链式反应中的研究进展

贾静
（国家知识产权局专利局专利审查协作广东中心,广州510530）

摘要：聚合酶链式反应（PCR）是现代分子生物学的核心技术之一，提高PCR扩增效率具有重要意义，传统方法具有众多局限性。碳纳米材料具有纳米材料特殊的性质，易与生物大分子蛋白质、核酸相互作用，对PCR扩增效率的提高具有重要的应用价值和理论意义。

关键词：聚合酶链式反应；碳纳米材料；特异性

1 引言

聚合酶链式反应(PCR)能够在体外扩增DNA，并能使微量的模板在数小时内以指数形式扩增数百万倍。在实际运用中，PCR技术还存在如假阳性、假阴性、扩增效率低等问题。为解决上述问题，科学家们主要从三个方面进行尝试和努力：一是调整PCR的参数，如调整聚合酶的种类或浓度、Mg2+浓度退火温度等；二是引入不同类型的添加剂对PCR体系进行优化，比如甲酰胺、二甲基亚砜、海藻糖[1-3]等；三是改进PCR扩增策略，如热启动PCR、巢式PCR、降落PCR等从传统PCR衍生出的策略。

碳纳米材料是指分散相尺度至少有一维小于100nm的碳材料。碳纳米材料按形态主要包括四种类型：片状（石墨烯），管状（碳纳米管），纤维状（碳纳米纤维）、球状（纳米碳球）是目前应用非常广泛的一类纳米材料。碳纳米材料能够与生物分子发生复杂的相互作用，因此很多学者将碳纳米材料引入PCR反应中，提高PCR反应的产量和特异性，拓展PCR技术的应用范围。

2 碳纳米材料在PCR中的应用

2.1 碳纳米管在PCR中的应用

2004年，Cui等[4]发现单壁纳米碳管(SWCNTs)可优化PCR反应。当PCR体系中的SWCNTs浓度低于3μg/μL时，产物的产量增加。SWCNTs的作用类似Mg2+，加入SWCNTs后即使反应液中无Mg2+，也不影响扩增。作者推测PCR各组分和SWCNTs充分接触后发生作用，提高PCR的反应产物的产量。XPS表明PCR反应后SWCNTs的C1s结合能增加，证实在PCR反应中SWCNTs与DNA模板、Taq聚合酶发生了强烈的相互作用，SWCNTs与PCR各组分之间发生了电子转移，SWCNTs的作用类似Mg2+，使Taq聚合酶保持高的反应活性。

2008年，Zhang等[5]研究了单壁碳纳米管(SWCNTs)和多壁碳纳米管(MWCNTs)对于Long PCR扩增特异性的影响。在PCR体系中添加不同管径的SWCNTs 和MWCNTs，调节体系中碳纳米管的浓度为0.8～1.6 mg/mL，扩增长度为14.3 kb 的DNA片断，可以提高PCR反应的特异性和产率。作者认为PCR效率提高是因为碳纳米管具有良好的导热性，而不是与PCR组分相互作用的结果。

2.2 碳纳米粉在PCR中的应用

2007年，Zhang等[6]将纳米碳粉(CNP)的悬浮液加入PCR体系，提高了多轮PCR和Long PCR的特异性。加入CNP后，在第6轮扩增中得到单一的目标条带。无CNP时，第4轮扩增开始出现非特异性条带，第5轮扩增几乎无目标条带。在Long PCR中，CNP显著减少非特异性条带。原子力显微镜表明CNP与双链DNA发生作用，

使引物和未完全退火的DNA结合在CNP上，阻止引物与DNA模板之间发生错配，减少引物二聚体的产生。

2.3 石墨烯在PCR中的应用

2012年，米丽娟等[7]研究了氧化石墨烯（GO）在PCR中的应用，发现添加0.2-2.5ng/μL GO可显著提高PCR的特异性和扩增产量，添加1ng/μL GO时，产量的提升尤为显著，产率达对照组的250%。在模板来源不同、浓度不同的PCR体系中分别加入 GO，发现添加GO的实验组灵敏度提高了1-3个数量级，并显著消除了引物二聚体，证明GO适用于各种浓度和复杂程度的DNA模板，甚至在模板量低于102拷贝数时也适用。

2012年，我们[8]研究了氧化石墨烯（GO）和还原石墨烯（rGO）对于多轮PCR反应特异性的影响。在两轮PCR中，GO的终浓度介于12-60μg/mL时明显提高第一轮PCR产物的特异性；以第一轮扩增产物为模板进行第二轮扩增，GO在上述浓度内无法提高PCR产物的特异性。然而，rGO在两轮PCR中，终浓度为10-12μg/mL时显著提高了PCR产物的特异性。此外，利用9轮PCR证实RGO对PCR特异性的影响，各轮PCR中加入12μg/mL rGO，对照组从第4轮开始已基本得不到产物，实验组甚至在8轮PCR反应后依然能够得到产物。还证实降低退火温度至25℃的情况下，加入rGO的PCR体系依然得到清晰的产物带。我们认为主要是石墨烯与pfu聚合酶的相互作用，负电位较弱的rGO与pfu聚合酶形成带正电的复合物，吸引带负电的DNA模板和引物到rGO的表面发生退火和延伸，降低非特异性反应的发生。