四川小麦品种抗条锈基因的SSR分析

康晓慧+彭玉姣+付菊梅+白雪+张春容+蔚慧欣

摘 要 从46对小麦基因组SSR引物中，筛选出带型清晰、稳定、多态性丰富的引物11对.利用该11对引物对52份抗病材料进行了遗传多样分析.结果表明，11对SSR引物共扩增出66个多态性位点，其中，每对SSR有1～10个，平均为6个.位点多态性指数（PIC）为0.75～0.90，平均为0.84.UPGMA聚类分析表明，SSR标记可将52份抗病品种分为3大类7个亚类.本研究对抗条锈基因功能分析及小麦抗条锈病分子辅助育种有参考价值.

关键词 小麦；抗病基因；条锈菌；SSR

中图分类号 S432.1 文献标识码 A 文章编号 1000-2537（2015）03-0011-05

小麦条锈病是由条形柄锈菌（Puccinia striiformis West.f.sp.tritici）引起的一种真菌性病害，给我国小麦生产造成严重的经济损失.近年来，四川麦区小麦条锈病每年都处于高发状态，造成每年3 Mt以上的粮食损失[1].国内外的研究表明，选育抗病品种是控制小麦条锈病最经济、有效和安全的途径.传统的育种方法周期长、工作量大、人为选择误差大，而分子标记是从DNA水平进行鉴定，弥补了传统育种方法的不足，大大加快了育种进程[2].其中SSR标记是目前小麦研究中应用最为广泛的一种DNA标记技术.本研究以52份四川小麦成株期抗锈品种为研究对象，利用小麦基因组中SSR标记对其从分子水平上进行遗传多样性分析，了解不同抗锈种质资源所携带抗锈基因的差异和抗锈种质资源之间的遗传关系，为利用有效的抗锈种质资源培育优质新品种提供理论依据.

1 材料与方法

1.1 试验材料

将52份抗性材料（见表1）用于SSR遗传多样性分析.

1.2 试验方法

1.2.1 黄化苗的培养 将成株期鉴定的52份抗病品种分别置于铺有湿纱布的培养皿中，上面盖纱布，于27 ℃恒温培养箱中进行黑暗培养，每天早晚补足水分，待黄化苗长到两片叶即可用于DNA的提取.

1.2.2 小麦DNA的提取 参照Rogers和Bendich（1985）[3]，Micheli等（1994）[4]的方法略改进.取100 mg新鲜小麦叶片，至液氮中研磨成粉末，加入预热的CTAB裂解缓冲液，加入等体积的氯仿与异戊醇（V氯仿∶V异戊醇=24∶1）反复抽提.取上清液加入10 μL RNAase，37 ℃水浴30 min，氯仿与异戊醇（V氯仿∶V异戊醇=24∶1）抽提一次，取上清液加入0.1倍体积的3 mol/L NaAc和2倍体积的冰冻无水乙醇沉淀DNA，可见团状DNA出现.将醋酸钠倒出，室温风干，然后加入100 μL 1XTE溶解，4 ℃保存备用.

1.2.3 模板DNA的检测 采用超微量分光光度计测定DNA纯度与浓度，读取OD值.OD260/OD280值范围在1.8～2.0最合适.再通过2%琼脂糖凝胶电泳进一步检测DNA纯度，若电泳后出现弱带或杂带，则说明DNA可能降解，即提取的DNA质量不高；若电泳后只有一条带明显，拖尾现象不严重，则说明DNA质量较高.

1.2.4 PCR扩增体系 PCR具体反应体系：2×Taq PCR Mix 12.5 μL，ddH2O 6.5 μL，10 μmoL/L F.P 2 μL， 10 μmoL/L R.P 2 μL，20 mg/L DNA 2 μL.

PCR反应程序为：94 ℃预变性5 min，94 ℃变性1 min，50～61 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，共35个循环；最后72 ℃延伸10 min.扩增产物经聚丙烯酰胺凝胶电泳，染色显影后统计谱带.

1.2.5 数据处理与分析 品种间遗传相似系数的计算参照Nei和Li[5]的方法；SSR扩增带型采用“0”，“1”和“9”来统计，分别表示在相同迁移水平上“有带”、“无带”和“缺带”；SSR引物的多态性信息指数（PIC）利用Senior等[6]提供的公式计算；利用NTSYS-PC 2.11[7]遗传分析软件进行数据处理.

2 结果与分析

2.1 抗锈品种DNA提取结果

将52份抗锈品种分别提取DNA，于紫外分光光度计上检测其纯度，同时结合2%琼脂糖凝胶电泳检测（图1），结果表明DNA的OD260/280在1.8～2.0之间，大部分结果显示拖带不太严重，适合下一步操作.

2.2 引物筛选

将52份抗锈品种对46对SSR引物进行筛选，从中选择多态性较好和条带清晰的11对引物（表2）.

2.3 SSR标记的多态性

利用表2中的11对引物对52份抗病品种进行分析，扩增结果条带清晰、多态性丰富，共检测到66个多态性位点，每对引物能检测到1～10个，平均为6个，见表3.其中Xwmc656和Xbarc187有10个多态性位点，多态性位点最小的引物是Xwmc626，其有2个多态性位点.位点多态性指数（PIC）为0.75～0.90，平均为0.84，多态性指数最大的引物是Xwmc656，最小的是Xwmc626.

2.4 SSR标记揭示品种间的遗传距离

根据SSR标记数据计算品种间的SSR遗传相似系数（表4），其变异范围为0.524～0.976，平均为0.75.在这些品种中川07005与西科麦2号，渝03062与sw18155和内麦10号，内麦8号与川麦55遗传相似性最高，相似系数为0.976；绵麦48和绵麦30，渝03062与绵麦48和绵麦30，绵麦41与绵麦48和绵麦30，西科1与绵麦367，绵麦31与331-60，绵麦41与绵麦46，内麦836与绵麦48和绵麦30的遗传相似系数为0.952；川07005与川麦55， 渝03062与内麦12和内麦8号，绵麦41与川麦51，蜀麦375和川麦42与川麦47的遗传相似系数为0.929；川06品09与渝03062，川06品09与西科麦5号，川06品09与川麦57，川麦54与内麦11，西科麦3号与川育23，内麦10号和内麦11与川麦53，内麦8号与川麦58，杏麦2号与渝03062，它们的遗传相似系数为0.905；其他品种间的遗传相似系数均小于0.9.

2.5 SSR遗传揭示供试品种（系）间的遗传关系

计算52份供试材料间的遗传距离，并以离差平方和方法进行聚类分析，建立树状聚类图（图2），52份材料在0.524水平上可分为三大类（表5）.

3 讨论

目前生产上推广的小麦品种绝大部分是繁6及其衍生系，致使四川小麦品种遗传基础狭窄，难以抵御条锈菌新小种的入侵，从而导致小麦条锈病的多次流行，严重降低了小麦产量和品质.利用物种内的遗传多样性，选用亲缘关系较远的抗性品种作杂交亲本，以此来培育高抗品种，是控制作物病害的一种有效的生态方法[8].前人已利用同工酶、种子贮藏蛋白、醇溶蛋白等不同手段对四川地方小麦品种进行了遗传多样性研究，发现四川地方品种变异较小、遗传多样性较低[9-12].陈玉清[13]、郑有良[14]采用RAPD标记对四川近50年来的小麦品种间遗传多样性进行研究，结果显示各年代间变化不一致，20世纪90年代后遗传多样性呈下降趋势.

本研究利用SSR标记技术对52份四川抗病材料进行遗传多样分析.结果发现，川07005与西科麦2号、渝03062与sw18155和内麦10号、内麦8号与川麦55遗传相似性最高，相似系数为0.976；川麦55与乐麦、331-60，sw2962与川育24、杏麦2号等相似系数最低，为0.524.聚类分析显示，52份抗病品种在0.524水平上可分为三大类，渝03062与其余品种亲缘关系较远，川07005与内麦9号和绵麦40的亲缘关系较近，川05观08与川07005的亲缘关系较近.从整体来看，各科研单位的小麦品种遗传多样性差异不大，与前人的研究结果一致.这可能与各科研单位选用有限的骨干亲本抗源材料有关，也可能与长期演化过程中的天然杂交等因素有关.

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（编辑 王 健）