鼠曲草提取物及组分对α-淀粉酶的抑制作用

陆英，邓林燕，朱丽娜，李觅路*

(1.湖南农业大学园艺园林学院，湖南 长沙 410128；2.国家植物功能成分利用工程技术研究中心，湖南 长沙 410128)

鼠曲草(Gnaphlium affine D.Don)为菊科鼠曲草属植物，又名佛耳草、清明菜等。鼠曲草提取物具有抗氧化及光防护[1]、抗炎抑菌[2]、抑制醛糖还原酶[3]、保肝[4]、昆虫拒食[5]等作用。鼠曲草能抑制血小板凝集和黏连，预防中风、糖尿病及动脉粥样硬化等疾病的发生[6]。

α–淀粉酶抑制剂是糖苷水解酶抑制剂中的一种，它能有效抑制肠道内唾液及胰淀粉酶的活性，降低食物中淀粉糖类物质的分解吸收，从而起到降低血糖、血脂的作用[7]。在农业上，α–淀粉酶抑制剂能抑制昆虫消化道内α–淀粉酶的活性，刺激昆虫过量分泌消化酶，产生厌食反应，导致昆虫发育不良或死亡。近年来，α–淀粉酶抑制剂在医学及农业上得到了广泛应用。

笔者制备鼠曲草提取物，分离鉴定了鼠曲草提取物中的几个多酚类化合物，并研究了鼠曲草提取物及几个组分对α–淀粉酶的抑制作用及其中的一个组分抑制类型，旨在为鼠曲草资源的进一步开发利用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 供试鼠曲草与试剂

鼠曲草于2012年4月中旬购于湖南吉首。

猪胰α–淀粉酶(SIGMA公司)；阿卡波糖(北京拜耳医药保健有限公司)；可溶性淀粉(汕头市西陇化工有限公司)；葡萄糖(国药集团化学试剂有限公司)；二水磷酸氢二钠、氯化钠、正磷酸、3,5–二硝基水杨酸、氢氧化钠、四水酒石酸钾钠等均为国产，分析纯。

1.2 仪器

LC–10AT 高效液相色谱(日本岛津公司)，WondasilTMC18色谱柱(250 mm×4.6 mm, 5 μm)；HH 数显恒温水浴锅(江苏省金坛市金城国胜实验仪器厂)；UV–2600 型紫外可见分光光度计(尤尼柯(上海)仪器有限公司)；SK–1 快速混匀器(江苏省金坛市荣华仪器制造有限公司)。

1.3 鼠曲草提取物的制备、分离和鉴定

鼠曲草提取物的制备：新鲜的鼠曲草于室内自然阴干，置60℃烘箱中干燥后粉碎。取鼠曲草粉碎原料200g，用70%乙醇，料液比为1∶30，在80℃回流提取1 h，提取2次，合并提取液，过滤减压浓缩至无醇味，用盐酸调节pH 至3.0，将提取液通过D101 树脂(3 cm×60 cm，450mL)上样，流速4 BV/h，吸附后静置0.5 h，用1 BV 水洗去水溶性杂质，再用4 BV 的60%乙醇以3 BV/h 的流速洗脱，减压浓缩后冷冻干燥，得鼠曲草提取物6.44g，于4℃冰箱中保存。

鼠曲草提取物的分离和鉴定：采用分析型高效液相色谱仪对提取物进行分离鉴定。色谱条件如下：流动相A 泵为0.5% 冰乙酸，B 泵为甲醇。梯度洗脱：0min(70%A 泵+30% B 泵)→15min(55%A泵+45% B 泵)→25min(55%A 泵+45% B 泵)→40min(30%A 泵+70% B 泵)，流速为1mL/min，柱温为30℃，进样量为20 μL，检测输出波长328 nm。

1.4 鼠曲草提取物及组分对α–淀粉酶的抑制作用试验

1.4.1 最适酶浓度和最适反应时间的选择

取7支试管，分别加入质量浓度为0.02mg/mL的α–淀粉酶0.1mL，置于37℃水浴中预热10min，加入37℃预热的1%淀粉溶液0.1mL，酶反应开始后准确计时，每间隔1min加入0.2mL DNS终止反应，置沸水中水浴8min，迅速冷却后用5mL蒸馏水稀释，用分光光度计于540 nm处测定吸光值。改变酶浓度(0.04、0.06、0.08、0.1mg/mL)，同法测定吸光值，作图确定最适酶浓度和最适反应时间。

1.4.2 鼠曲草提取物及组分对α–淀粉酶的抑制作用试验

取0.1mL质量浓度为0.06mg/mL猪胰α–淀粉酶溶液于试管中，分别加入0.1mL不同浓度(1.0、2.0、3.0、4.0、5.0mg/mL)的样品溶液(以阿卡波糖为阳性对照)，混合均匀并置于37℃水浴中预热10min，加入0.1mL 37℃预热的1%淀粉溶液，混匀，反应3min后立即加0.2mL DNS显色剂，置沸水中水浴8min，迅速冷却后用5mL蒸馏水稀释，用分光光度计于540 nm处测定吸光值A1。以空白管为对照，不加抑制剂(以蒸馏水补足)，其他与抑制剂管操作相同，测定吸光值A0。背景管为对应浓度的抑制剂溶液，不加酶液(以蒸馏水补足)，其他与抑制剂管操作相同，测定吸光值A2，按下列公式计算抑制率。

1.5 2´,4,4´–三羟基–6´–甲氧基–查尔酮–4´–O–β–D–葡萄糖抑制类型的鉴别试验

2´,4,4´–三羟基–6´–甲氧基–查尔酮–4´–O–β–D–葡萄糖的质量浓度为3mg/mL，底物为1%淀粉溶液，以缓冲溶液替代样品溶液，在不同的酶浓度(0.02、0.04、0.06、0.08mg/mL)下按1.4.2反应测定吸光值。当体系中不存在抑制剂时，酶活性测定的速率直线通过原点；当体系中存在不可逆抑制剂时，酶反应速率直线不通过原点，相当于将原点平行向右移动，若有一定量的可逆性抑制剂时，可得到一条通过原点、斜率低于无抑制剂组的直线。如果2´,4,4´–三羟基–6´–甲氧基–查尔酮–4´–O–β–D–葡萄糖是可逆性抑制类型化合物，则进一步进行可逆性抑制类型(竞争型和非竞争型)的鉴别试验。试验操作如下：固定酶质量浓度为0.06mg/mL，2´,4,4´–三羟基–6´–甲氧基–查尔酮–4´–O–β–D–葡萄糖质量浓度为3mg/mL，以淀粉溶液为底物，在不同浓度(0.5%、1%、1.5%和2%)的淀粉溶液下，按1.4.2 反应测定吸光值，通过双倒数作图法判断是竞争型或非竞争型抑制类型。两条直线的交点在纵轴为竞争型抑制剂，在横轴上的为非竞争型抑制剂。

2 结果与分析

2.1 鼠曲草提取物的HPLC 分析

鼠曲草提取物的HPLC 色谱图见图1。由图1可见，提取物中含有多个组分，其中含量相对较高的有7个组分，在330 nm 和220 nm 左右有较大吸收，具有明显的酚酸类化合物的紫外吸收特征[9]，推测为多酚类化合物。本课题组从鼠曲草提取物中制备分离得到了7个组分，并鉴定出编号为3、5、7 的组分分别为3,5–O–咖啡酰基奎宁酸、3,4–O–咖啡酰基奎宁酸、2´,4,4´–三羟基–6´–甲氧基–查尔酮–4´–O–β–D–葡萄糖。

图1 鼠曲草提取物的HPLC 图谱 Fig.1 HPLC chromatogram of the extract from Gnaphalium affine D. Don

2.2 鼠曲草提取物及组分对α–淀粉酶的抑制作用及抑制类型鉴别结果

2.2.1 最适酶浓度和最适反应时间的确定

不同质量浓度的α–淀粉酶在7min内的反应动力学进程曲线见图2。当酶质量浓度等于或低于0.08mg/mL时，在3min之内反应均为线性反应。同时，为利于建立科学的反应动力学方程，使测定的反应速率(以ΔA/min表示)在(0.03～0.25)/min较好[9]，因此，选取最佳酶浓度0.06mg/mL，反应时间3min进行酶反应动力学的测定。

图2 不同质量浓度α–淀粉酶的反应进程曲线 Fig.2 The reaction curve under different concentrations of α- amylase

2.2.2 鼠曲草提取物及3个组分对α–淀粉酶活性的影响

不同浓度的鼠曲草提取物及化合物对α–淀粉酶的抑制活性见表1。在试验浓度范围内，样品对α–淀粉酶活性均有一定抑制作用，随着浓度的增加，抑制能力逐渐增强。当提取物、组分3、5、7及阳性对照阿卡波糖质量浓度为1.67mg/mL时，抑制率分别为32.37%、84.53%、63.07%、71.22%、94.12%。对样品浓度与抑制率进行线性拟合，得到线性方程为：y提=17.265x + 3.237(R2= 0.998 4)；y3=45.429x + 9.247(R2= 0.997 6)；y5= 34.041x + 6.555(R2= 0.999 4)；y7=40.239x + 3.293(R2=0.993)；y阿=28.92x + 47.194 (R2=0.988 9)。根据方程计算出提取物及化合物3、5、7对α–淀粉酶的半抑制浓度IC50分别为2.71、0.90、1.28、1.16mg/mL，均高于阿卡波糖的半抑制浓度(0.10mg/mL)。

表1 样品对α–淀粉酶的抑制作用 Table 1 Inhibitory effect of coumpounds from Gnaphalium affine D. Don on α-amylase

2.2.3 2´,4,4´–三羟基–6´–甲氧基–查尔酮–4´–O–β–D–葡萄糖对α–淀粉酶的抑制类型

不同浓度的α–淀粉酶在有或无2´,4,4´–三羟基–6´–甲氧基–查尔酮–4´–O–β–D–葡萄糖存在的条件下的反应速率见图3。无抑制组的速率方程为y=0.488 5x(R2=0.986)，抑制组的速率曲线方程为y=0.269 5x (R2=0.987 8)，此直线通过原点，由此可知，化合物7对α–淀粉酶的抑制类型是可逆性抑制。由图4可知，抑制组双倒数曲线方程为y=288.91x+ 54.848(R2=0.978 4), 无抑制组双倒数曲线方程为y=145.81x+27.94 (R2=0.997 4)，方程直线在横轴上相交，为非竞争性抑制。

图4 化合物7对胰α–淀粉酶的可逆抑制类型的双倒数曲线 Fig.4 Lineweaver-burk plot for inhibition of compound 7 on α–amylase

3 结论

植物多酚由于具有良好的抗氧化和自由基清除活性而受到广泛关注。近些年进一步研究[10–12]表明，一些植物的多酚如蓝莓提取物、茶多酚等具有 较强的α–淀粉酶抑制活性。本试验结果表明，鼠曲草提取物及其中的3个多酚类化合物对胰α–淀粉酶均具有较强的抑制作用，且呈明显的量效关系，但不同化合物的抑制活性存在一定差异，3,5–O–咖啡酰基奎宁酸、3,4–O–咖啡酰基奎宁酸为异绿原酸类化合物的同分异构物，但二者抑制α–淀粉酶的IC50分别为0.90、1.28mg/mL；2´,4,4´–三羟基–6´–甲氧基–查尔酮–4´–O–β–D–葡萄糖是一种查尔酮，它的IC50为1.16mg/mL，同时它为可逆的非竞争性抑制类型。

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