丙型肝炎患者血清自身抗体检测的相关分析

涂业桃，张筱惠，邓 剑

（四川医科大学第一附属医院：1.输血科；2.检验科，四川泸州646000）

丙型肝炎患者血清自身抗体检测的相关分析

涂业桃1，张筱惠2，邓 剑2

（四川医科大学第一附属医院：1.输血科；2.检验科，四川泸州646000）

目的 了解慢性丙型肝炎患者血清中自身抗体阳性率，探讨自身免疫在丙型肝炎病毒（HCV）感染中的意义。方法 选取2014年1月至2015年3月该院收治的丙型肝炎患者127例作为丙型肝炎组，另选取同期该院体检中心健康体检者30例作为对照组。采用间接免疫荧光法（IIF）检测两组受检者血清中抗核抗体（ANA），免疫印迹法检测抗线粒体抗体（AMA）、抗可提取性核抗原（ENA）抗体、抗肝抗原抗体谱，采用实时荧光定量PCR法检测血清 HCVRNA含量。结果 丙型肝炎组有61例检测出1项或1项以上自身抗体阳性，自身抗体阳性率为48.03%（61/127），高于对照组的3.33%（1/30），差异有统计学意义（P＜0.01）。丙型肝炎组HCV-RNA阳性46例，其中自身抗体阳性29例（63.04%），HCV-RNA阴性81例，自身抗体阳性32例（39.51%），两组比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。结论 HCV感染机体可诱发自身免疫反应，产生多种自身抗体，尤其以HCV-RNA阳性患者更为明显，HCV感染者有必要进行血清自身抗体检测，从而指导临床医生对患者实施个体化治疗。

肝炎，丙型； 肝炎病毒/免疫学； RNA，病毒； 肝炎，自身免疫性； 自身抗体

丙型肝炎是由丙型肝炎病毒（hepatitis C virus，HCV）引起的全世界流行的传染病，其主要传播方式为输血等血液接触传播。HCV感染后患者无明显的临床症状，容易被忽视，但其在体内长期存在可导致肝硬化和肝细胞性肝癌，因此也越来越受到临床的重视[1]。近年来，随着对HCV研究的深入，人们认识到HCV感染者血清中常可以检测出自身抗体，自身抗体可导致多种组织器官功能的紊乱，加重丙型肝炎患者的病毒血症[2-3]。本研究通过对127例丙型肝炎患者血清中自身抗体的检测，分析HCV患者与血清中自身抗体的相关性，有助于了解患者自身免疫状态并指导临床治疗。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2014年1月至2015年3月本院门诊收治和住院的丙型肝炎患者127例作为丙型肝炎组，其中男69例，女58例；年龄16～81岁，平均（54.56± 13.42）岁。临床诊断符合2004年中华医学会肝病学分会、中华医学会传染病与寄生虫病学分会制订的诊断标准[4]。根据HCV-RNA阴性和阳性，将127例HCV患者分成HCV-RNA阴性组（81例）和HCV-RNA阳性组（46例）。另选取本院体检中心健康体检者30例作为对照组，其中男18例，女12例；年龄18～75岁，平均（43.78± 10.63）岁。所有对照组受检者均排除病毒感染、自身免疫性疾病及其他引起免疫功能改变的疾病。所有患者在近3个月内均未使用免疫制剂。

1.2 方法

1.2.1 血清中抗核抗体（anti-nuclear antibody，ANA）、抗线粒体抗体（anti-mitochondrial antibody，AMA）检测ANA、AMA检测采用间接免疫荧光法（indirect immunofluorescence，IIF）。ANA检测基质选用HEP-2细胞和猴肝组织的冰冻切片作为靶抗原；AMA检测基质选用鼠肾组织的冰冻切片作为靶抗原。待检测血清1∶100稀释，将稀释的待测血清与生物载片（反应区内固定有包被基质的生物薄片）共同温育30 min，加入异硫氰酸荧光素（fluorescein isothiocyanate，FITC）标记的抗体（荧光二抗）第2次温育30 min，洗片，甘油封片后荧光显微镜下观察结果。组织或细胞内出现特征性绿色荧光，滴度大于或等于1∶100时为阳性。间接免疫荧光样本前处理仪IF Sprinter及所有试剂购自德国欧蒙公司。所有步骤严格按说明书操作。

1.2.2 抗可提取性核抗原（anti-extractable nuclear antigen，ENA）检测 应用免疫印迹法检测ENA（包括15种靶抗原：nRNP/Sm、Sm、SSA、Ro-52、SSB、Scl-70、PM-Scl、Jo-1、CENPB、PCNA、dsDNA、Nucleosomes、Histones、Rib.P-Prot、AMA-M2）抗体、抗肝抗原抗体谱[包括AMA-M2、抗可溶性肝抗原抗体（抗SLA抗体）、抗肝/肾微粒体1型抗体（抗LKM-1抗体）和抗肝细胞胞质抗原1型抗体（抗LC-1抗体）4种抗体]。将包被有各种抗原的检测膜条放置于温育槽内，膜条上有编号的一面朝上。在温育槽中分别加入1.5 mL样本缓冲液，振荡孵育5min后，吸去温育槽中的液体。再加入1.5 mL 1∶100的已稀释血清样本，室温振荡孵育30 min。吸去液体，用1.5 mL缓冲液清洗膜条3次，每次5 min。加入1.5 mL已稀释的碱性磷酸酶标记的抗人IgG，再振荡孵育30 min。清洗3次，每次5min。加入1.5mL底物液，温育10min。蒸馏水洗3次，每次1 min。风干后判定膜条上结果。全自动蛋白印迹仪EURO Blotmaster购自德国欧蒙公司，试剂由欧蒙医学实验诊断公司提供。所有步骤严格按说明书操作。

1.2.3 HCV-RNA检测 采用HCV核酸定量检测试剂盒（深圳凯杰生物工程有限公司）及实时荧光定量PCR系统（real time PCR system，美国ABI7500 Fast基因扩增仪）检测HCV RNA。

1.2.4 HCV抗体检测 采用ELISA法进行HCV抗体检测，试剂盒购自北京万泰生物药业股份有限公司。所有步骤严格按说明书进行操作。

1.2.5 统计学处理 应用SPSS17.0统计软件进行数据分析，计数资料以率或构成比表示，采用χ2检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 两组受检者自身抗体阳性情况 丙型肝炎组中，有61例患者检测出1项或1项以上自身抗体阳性，检出率为48.03%（61/127）；对照组中有1例检测出自身抗体阳性，检出率为3.33%（1/30），两组比较，差异有统计学意义（P＜0.01）。见表1。

表1 两组受检者自身抗体阳性情况[n（%）]

2.2 丙型肝炎患者HCV-RNA与自身抗体的关系 HCVRNA阳性组患者中自身抗体检出率为63.04%（29/46），HCV-RNA阴性组中自身抗体检出率为39.51%（32/81）；两组比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。

3 讨 论

丙型肝炎是全世界流行的传染病，由HCV感染所致，其在我国的感染率仅次于乙型肝炎病毒（HBV）。HCV感染后患者起初无明显临床症状，极易慢性化，继而演变为肝硬化和肝细胞性肝癌，严重威胁着人类的健康[5]。

HCV感染存在自身免疫现象，慢性丙型肝炎患者血清中常可以检出多种自身抗体。有研究表明，自身免疫性疾病的启动因子是病毒感染，靶细胞的抗原成分改变或病毒蛋白与正常组织细胞的同源性可诱发自身免疫，并认为HCV感染可通过分子模拟现象激活自身免疫反应性CD8+T细胞，从而导致自身免疫反应[6]。而自身免疫是机体对自身组织成分免疫应答过于亢进的表现，可能为丙型肝炎患者肝功能损害的主要因素之一。目前临床上对于慢性丙型肝炎的治疗主要采用干扰素联合利巴韦林，此方案对低效价自身抗体的丙型肝炎患者有较好疗效，但由于干扰素治疗可能会诱发患者出现自身免疫性疾病，特别是对于高滴度自身抗体的丙型肝炎患者[7-8]。因此，丙型肝炎患者进行自身抗体检测及病毒载量分析，有助于了解患者自身免疫状态及指导临床选择治疗方案。

本研究结果显示，48.03%（61/127）的患者至少检测出一项自身抗体阳性，其中以ANA的阳性率最高（41.73%），其次为抗ENA抗体（29.92%），然后为AMA（6.30%）和抗肝抗原抗体谱（3.94%）。以上4种自身抗体的阳性率及总阳性率均明显高于对照组，提示HCV感染可诱发自身免疫反应，使患者出现多种自身抗体，这往往提示体内免疫功能已出现紊乱，同时也可能提示有利于病毒复制。本文HCV-RNA阳性组中自身抗体检出率为63.04%，HCV-RNA阴性组中自身抗体检出率为39.51%。HCVRNA阳性的丙型肝炎患者其自身抗体的阳性率高于单纯抗HCV阳性丙型肝炎患者，自身抗体的出现与HCV复制活跃呈密切正相关，与王蓉等[9]报道一致。这在一定程度上说明HCV-RNA阳性的丙型肝炎患者发生自身免疫反应更为严重[10]。

ANA对于很多自身免疫性疾病有诊断价值。在不同疾病中，特别是风湿性疾病，其抗体谱有一定的特异性，检测ENA对于不同类型风湿病（如类风湿关节炎、系统性红斑狼疮、进行性系统性硬化病、干燥综合征等）意义重大。在许多自身免疫性疾病中检测到AMA具有诊断价值，尤其是对诊断原发性胆汁性肝硬化（primary biliary cirrhosis，PBC）有着特殊意义。PBC是一种原因不明的慢性炎症性肝脏疾病，被认为是一种自身免疫性疾病，检测AMA中的AMA-M2是PBC的一个灵敏而特异的诊断指标。而抗肝抗原抗体谱中SLA、LKM-1、LC-1抗体被认为是自身免疫性肝炎的主要标志性抗体。

已有研究结果证实，诱发自身免疫是HCV致病的一个重要机制，约1/3的HCV感染者血清中可检测到针对肝细胞成分自身抗体[11]，如AMA-M2、SLA、LKM-1等，它们可加重肝细胞损伤，诱发自身免疫性肝炎（autoimmune hepatitis，AIH）、原发性胆汁性肝硬化等自身免疫性疾病。大多数情况下，丙型肝炎与AIH较容易鉴别，但是当病毒感染和自身免疫现象共存时，由于激发丙型肝炎自身免疫反应的抗原较弱，鉴别常比较困难。鉴于AIH与丙型肝炎的关系密切，且治疗原则截然不同（临床上对于AIH的治疗首选皮质类固醇激素或其他免疫抑制剂，而丙型肝炎则采用利巴韦林联合干扰素），正确区分合并HCV感染的自身免疫性肝炎和伴自身免疫现象的丙型肝炎显得尤为重要[2]。自身抗体的检测有助于AIH和丙型肝炎的鉴别诊断，AIH患者所产生的自身抗体中，最常见、发现最早的自身抗体是ANA。邓纪望等[12]指出，AIH患者血清中ANA的阳性率高于丙型肝炎患者，且AIH患者ANA以高滴度为主，丙型肝炎患者则以低滴度抗体为主。因此，检测患者ANA阳性率及滴度，对AIH和丙型肝炎的鉴别诊断和制订有效的治疗方案具有重要意义。

综上所述，HCV感染机体后可通过多种途径损害免疫系统，破坏机体的免疫耐受性，诱发自身免疫反应。同时，HCV复制可促进自身免疫异常，进一步加重肝脏损害，使病情迁延不愈。而关于HCV感染者合并自身免疫现象，以及自身免疫性疾病是否与血清中存在的自身抗体相关，存在自身抗体的HCV感染者并发自身免疫性疾病的概率及对疾病的严重程度和转归有何影响，目前尚无定论，还有待进一步临床验证，因此，临床医生应高度重视合并自身免疫性肝病的HCV感染者的个体化治疗。

[1]覃益华.丙型肝炎患者自身抗体检测115例结果分析[J].医学信息，2011，24（4）：1292-1293.

[2]赵平，王江滨，焦健.慢性丙型肝炎患者合并肝外自身免疫现象及自身抗体分析在与自身免疫性肝炎鉴别诊断中的意义[J].中国老年学杂志，2010，30（15）：2097-2099.

[3]林华，林亦可，林丽容.莆田地区慢性丙型肝炎患者血清自身抗体的检测及意义[J].海峡预防医学杂志，2011，17（5）：72-73.

[4]中华医学会肝病学分会，中华医学会传染病与寄生虫病学分会.丙型肝炎防治指南[J].中华内科杂志，2004，43（7）：551-555.

[5]江跃红，江跃红，迟伟群，等.206例抗-HCV抗体检测阳性分析[J].黑龙江医学，2010，34（3）：211-212.

[6]彭道荣，余妍，王宇，等.丙型肝炎病毒感染患者血清肝特异性自身抗体的检测及临床研究[J].实用预防医学，2007，14（6）：1699-1671.

[7]潘闻，张世斌，王贞彪.非器官特异性自身抗体对慢性丙型肝炎抗病毒疗效的影响[J].中国误诊学杂志，2010，10（12）：2776-2777.

[8]李新华，张爱秋，曹春蕊，等.慢性丙型肝炎伴自身抗体阳性患者的抗病毒治疗临床观察[J].中国热带医学，2011，11（7）：886-887.

[9]王蓉，耿秀蓉，覃沙，等.自身抗体在丙型肝炎和自身免疫性肝炎中的特点分析[J].四川医学，2011，32（2）：253-256.

[10]Squadrito G，Previti M，Lenzi M，et al.High prevalence of non-organ-specific autoantibodies in hepatitis C virus-infected cirrhotic patients from southern Italy[J].Digest Dis Sci，2003，48（2）：349-353.

[11]白丽，陆海英，冯珍如，等.慢性丙型肝炎患者血清ANA，anti-LKMI的检测及其产生机制探讨[J].中国实验与临床病毒学杂志，2009，23（4）：278-281.

[12]邓纪望，蔡燕玲，何以雅.不同荧光模式ANA、ASMA在自身免疫性肝炎与慢性丙型肝炎中的诊断价值[J].实验与检验医学，2010，28（2）：147-148.

Analysis on correlation of serum autoantibodies detections in patients with hepatitis C

Tu Yetao1，Zhang Xiaohui2，Deng Jian2
（1.Department of Blood Transfusion；2.Department of Clinical Laboratory，First Affiliated Hospital of Sichuan Medical University，Luzhou，Sichuan 646000，China）

Objective To understand the positive rate of serum autoantibodies in the patients with chronic hepatitis C and to investigate the significance of autoimmune in hepatitis C virus（HCV）infection.Methods 127 hepatitis C patients treated in our hospital from January 2014 to March 2015 were selected as the hepatitis C group and 30 persons undergoing the healthy phys icalexamination were selected as the controlgroup.The indirectimmunofluorescence（IIF）method was adopted to detect antinuclear antibody（ANA），the immunoblotting method was adopted to detect anti-mitochondrial antibody（AMA），anti-extractable nuclear antigen（ENA）and anti-liver antigen antibody spectrum，The serum HCV-RNA content was detected by using by fluorescence quantitative polymerase chain reaction（PCR）.Results 61 cases in the hepatitis C group were detected in one item or more of au toantibodies positive，the autoantibody positive rate was 48.03%（61/127），which was higher than 3.33%（1/30）in the control group，the difference was statistically significant（P＜0.01）；in the hepatitis C group，46 cases were HCV-RNA positive，in which 29 cases（63.04%）were autoantibody positive，81 cases were HCV-RNA negative，32 cases（39.51%）were autoantibody positive，the differences between the 2 groups were statistically significant（P＜0.05）.Conclusion HCV infection in the body can induce the autoimmune reaction and produce a variety of autoantibodies，which is more significant especially in the patients with HCVRNA positive.It is necessary for the HCV infected person to test the serum autoantibodies，thus guide the clinical doctors to implement the individualized treatment for the patients.

Hepatitis C； Hepatitis viruses/immunology； RNA，viral； Hepatitis，autoimmune； Autoantibodies

10.3969/j.issn.1009-5519.2015.23.007

A

1009-5519（2015）23-3546-03

2015-08-09）

涂业桃（1971-），男，四川泸州人，主管技师，主要从事临床输血与免疫学检验工作；E-mail：511383487@qq.com。