无致病力青枯菌株对烟草青枯病的控制作用

陈国康，周帮菊，周丹妮，肖崇刚，马冠华，董国菊

西南大学植物保护学院，重庆市北碚区天生路2号 400716

无致病力青枯菌株对烟草青枯病的控制作用

陈国康，周帮菊，周丹妮，肖崇刚*，马冠华，董国菊

西南大学植物保护学院，重庆市北碚区天生路2号 400716

为进一步揭示无致病力菌株对烟草青枯病的控病机理，以无致病力青枯菌株为材料，针对烟草青枯病进行了温室控病及田间小区试验，并通过抗药性标记测定其抗药性突变菌株在烟株体内的定殖状况，同时分析处理后烟株体内苯丙氨酸解氨酶（PAL）、过氧化物酶（POD）、多酚氧化酶（PPO）的活性变化。结果显示:无致病力菌株Tbw1-7-3在温室盆栽条件下对青枯病的相对防效达89.4%，其田间防效在发病初期10～20 d与药剂农用链霉素处理间无明显差异，且其抗药性突变株在烟株根表和体内可短暂定殖。同时菌株Tbw1-7-3能提高寄主中PAL、POD和PPO 3种酶活性及促进病程相关蛋白（PRP）的积累。无致病力菌株对烟草青枯病具有较好的控制作用，以菌株Tbw1-7-3的防效最优。田间试验也显示Tbw1-7-3菌株在发病初期具有良好的控病效果。无致病力青枯菌株的控病机理可能兼有占位效应及诱导抗病性。

烟草青枯病；无致病力菌株；生物防治；控病机理

近年来由青枯雷尔氏菌（Ralstonia solanacearum E F Smith）引起的青枯病在我国南北方烟区普遍发生，常造成全株性萎蔫死亡，对烟草安全生产构成较大威胁［1-2］。利用无致病力青枯菌株防治作物青枯病，是目前植物病害生物防治的研究重点之一，并已有成功应用的案例［3-5］。一般认为是无致病力菌株所产细菌素发挥了控病作用［4-5］，或诱导了寄主作物的抗病性［6］。另有学者提出产细菌素的无致病力青枯菌株对青枯病具有较好的短期防效，可能还存在诱导抗性以及不同致病力菌株间的微生态竞争［7］。但目前无致病力青枯菌株防治青枯病的研究还停留在实验室阶段，鲜有田间试验应用效果的报道。同时，无致病力青枯菌株分离自植物体内，具有对环境安全的优势，且进入寄主的方式与致病菌相同。因此，以无致病力青枯菌株为生物防治材料，分析其控病效果及可能的作用机制，旨在为烟草青枯病的有效防治提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

供试菌株：实验室前期研究获得的无致病力青枯菌Tbw1-7-3、Aujd5-2y、Aujd11-1-4、Tm002-2r、Tbw1-7-1-3、Tbw1-7-1-1、Tbw1-7-2和Tbw1-7-1-2 8个菌株，青枯致病菌FL-9-1菌株；烟草品种MSK326；对照药剂为农用链霉素（石家庄曙光制药厂生产）、硫酸链霉素和利福平（市售）。

1.2 方法

1.2.1 烟草青枯病温室控病试验

Tbw1-7-3等8株无致病力待测菌及青枯病菌，均采用伤根接种法［8］。选择5～7叶期的盆栽自育烟苗，伤根接种待测菌发酵液，浓度4.0×108cfu/mL，接种量10 mL/株，每菌接种10株，3次重复。并于第一次接种后7 d再次伤根接种青枯菌FL-9-1菌悬液，浓度3.0×108cfu/mL、接种量10 mL/株，置于30℃人工温室中促其发病。同时设置无菌水空白对照（CK空白）、仅接种病原菌的发病对照（CK病）和接种病原菌后再施用药剂的防病对照（CK药，农用链霉素浓度100 μg/mL，按10 mL/株灌根）。调查并记录青枯病发病的严重度［9］。

1.2.2 烟草青枯病田间小区控病试验

烟苗移栽前7 d，将浓度为3.0×108cfu/mL青枯致病菌发酵液均匀喷雾到土壤中制备病圃，施用量为200 mL/m2，同时将盆栽控病效果优良的菌株Tbw1-7-3发酵液以10 mL/株对烟苗灌根，分别于移栽后7 d及CK病首次出现症状时，将菌株Tbw1-7-3发酵液（100 mL/株）灌根，浓度为8.0×108cfu/ mL。CK药：同样于烟苗移栽7 d后及CK病初见症状时，以150 μg/mL农用链霉素100 mL/株灌根施用。

1.2.3 抗药性标记及在烟草体内的定殖

对控病效果优良的菌株Tbw1-7-3进行抗药性标记［10-11］，将获得的突变菌株命名为Tbw1-7-3k。用突变株灌根接种烟苗，方法同温室控病试验。于处理后0.5、3.0、7.0、14.0、21.0和28.0 d分别采用组织印迹法和稀释平板法［12］检测突变菌株在烟苗根、茎和叶中的定殖状况。

1.2.4 无致病力青枯菌株诱导烟草的抗病性

接种处理：按温室控病方法进行伤根接种，分别为灌根等量无菌水（CK空白）、无致病力菌株Au004-1（CK阳性）发酵液和菌株Tbw1-7-3发酵液。于处理后1、3、5、7、9和11 d分别采集自顶叶向下数第4片完全展开叶作为测定酶活性样品。

酶活性测定：参照李合生［13］的方法提取苯丙氨酸解氨酶（PAL）并测定活性；参照陈志谊等［14］的方法提取过氧化物酶（POD）并测定活性；参照李靖等［15］的邻苯二酚法提取多酚氧化酶（PPO）并测定活性；参照江山等［16］和Boller等［17］的细胞间隙可溶性蛋白提取法提取病程相关蛋白（PRP），再经电泳分析［18］测定处理后第3天的叶片样品。

2 结果与分析

2.1 温室控病试验

将平板抑菌效果较好的8个菌株用于温室控病试验。结果（表1）显示：对烟草青枯病防效在80%以上的菌株有5个，其余3个菌株的防效在60%～80%之间。菌株Tbw1-7-3、Aujd5-2y和Aujd11-1-4处理的相对防效显著高于其他菌株（P＜0.05）。

表1 供试菌株的温室控病试验结果①Tab.1The results of antagonistic strains against tobacco bacterial wilt in greenhouse

2.2 田间小区控病试验

烟苗移栽30 d后，发病对照烟株开始出现发病症状，此后田间调查缩短为每5天1次。试验结果（表2）显示：在CK病初见发病后10 d，菌株Tbw1-7-3处理和农用链霉素处理开始出现病株，均不同程度地延迟了青枯病的发生期；在CK病发病后第10～20天时两者的田间相对防效接近，两处理间无显著差异，但均出现下降趋势；在CK病发病后30 d，菌株Tbw1-7-3处理和农用链霉素处理对烟草青枯病的防效均降至较低水平，且菌株Tbw1-7-3下降趋势更加明显。

表2 田间小区控病试验相对防效①Tab.2The relative control efficacy in field plot trials

2.3 抗药性标记及在烟株体内的定殖

通过抗药性标记得到抗Stre 250 μg/mL和Rif 200 μg/mL的双抗突变菌株Tbw1-7-3k，检测显示该菌株保持了较高的平板抑菌活性。采用伤根接种Tbw1-7-3k突变菌株后0.5～28 d，采用组织印迹法测定时仅在烟株根表检测到突变菌株，而稀释平板法则在烟株根、茎、叶内均检测到了突变菌株，这表明该菌可以在烟株体内定殖，甚至可能在一定范围内转移扩展。检测结果（表3）显示，接种处理后烟株体内的菌量呈先升高后降低的趋势，表明突变菌株在烟株体内只能短暂定殖。

表3 伤根接种后Tbw1-7-3k在烟株体内的定殖动态Tab.3The Population fluctuation of Tbw1-7-3k in tobacco plants after root-cutting inoculation

2.4 青枯无致病力菌株诱导烟株抗病性

与寄主抗性有关的酶活性测定结果（表4）显示：经供试菌株Tbw1-7-3处理后烟株体内的PAL和POD酶活性，均高于CK空白；而烟株体内PPO酶活性则是在处理后第9天迅速升至峰值，并持续处于高位。初步表明，菌株Tbw1-7-3能诱导烟株产生抗青枯病菌的物质，且与寄主体内的PAL、POD和PPO酶活性提高有关。

与寄主抗性有关的PRP测定结果（图1）显示：与CK空白相比，菌株Tbw1-7-3接种烟株后，电泳图谱尽管没有出现新的蛋白条带，但蛋白条带着色更深，着色程度在阳性菌株和CK空白之间。表明该菌株处理烟株后，可诱导寄主产生与抗病性有关的更多PRP。

表4 菌株Tbw1-7-3处理烟株叶片中PAL、POD和PPO酶活性的变化Tab.4The dynamics of activities of PAL,POD and PPO in tobacco leaves after Tbw1-7-3 treatment

图1 菌株Tbw1-7-3处理3 d后烟叶内PRP的电泳图Fig.1The electrophoresis of PRP in tobacco leaves three days after Tbw1-7-3 treatment

3 结论与讨论

控病试验显示，无致病力菌株对烟草青枯病具有控制效果，为今后的生产应用提供了控病生物防治资源。其中以接种Tbw1-7-3菌株的防效最优，田间试验也显示了该菌株在发病初期发挥了较好的控病作用。无致病力青枯菌株的控病机制可能兼有占位作用和抗性诱导，而非前人提出的单一作用［6-7］。

与药剂农用链霉素处理相比，Tbw1-7-3菌株在发病中后期的田间防效开始下降，在第30天下降最为明显。这种前期优异、后期颓势防效的特点是植物病害生物防治研究中易出现的问题。解决的可能途径：一是在初次施用拮抗菌株Tbw1-7-3后，每2周补施1次拮抗菌发酵液，连续2～3次，以提高拮抗菌在寄主体内的数量水平；二是在初次施用该拮抗菌株后2周改施农用链霉素1～2次，有助于达到持续控病的效果。

有研究提出根系伤口能促进拮抗菌进入番茄植株体内［19］，因此本试验中采用了伤根接种方法，并且得到了较理想的防效，再次印证了前人的结论。也表明伤口不仅是青枯致病菌［20］进入植物体的主要通道，也是无致病力青枯菌进入寄主的主要方式。无致病力菌株经人为造成的伤口进入寄主体内有利于发挥其占位作用，甚至影响寄主的生理生化过程，并在标记菌株的定殖测定中得到证实。同时，也为生产上施用无致病力菌株伤根接种提供了依据。

研究显示供试突变菌株Tbw1-7-3k可在烟株根表和土壤中存活，并在烟草体内转移和定殖。菌株Tbw1-7-3k在烟株内的数量呈现先上升后下降的特点，表明该菌在烟草体内仅能短期定殖，显示了一定的占位效应，这也为解释初始菌株Tbw1-7-3田间防效后期下滑的现象提供了依据。原因可能是土壤中其他微生物等环境因子抑制了该菌株的增殖［5］。其作用机制有待进一步的研究。

试验显示无致病力菌株Tbw1-7-3具有诱导烟株产生抗青枯病物质的作用，与前人的研究结论基本一致［21-22］。本试验中测定了与寄主抗性相关的酶活性及PRP。但该菌株诱导烟株积累较多PRP，仅表现为促进PRP含量增加，并没有产生新的PRP。可能是由于供试菌株非源自烟株本身，而是从番茄青枯病株上分离获得，其作用机制仅是激活了烟株固有的与PRP抗性蛋白相关的代谢过程。

［1］刘先良，习向银，申鸿，等.接种丛枝菌根真菌对烟草青枯病抗性的影响［J］.烟草科技，2014（5）：94-98.

［2］万川，蒋珍茂，赵秀兰，等.深翻和施用土壤改良剂对烟草青枯病发生的影响［J］.烟草科技，2015，48（2）：11-15，20.

［3］陈庆河，翁启勇，胡方平.无致病力青枯菌株对番茄青枯病的防治效果［J］.中国生物防治，2004，20（1）：42-44.

［4］郑继法，张建华，许永玉，等.利用无毒产细菌素菌株防治烟草细菌性青枯病［J］.中国烟草，1994（3）：21-24.

［5］郑雪芳，刘波，蓝江林，等.无致病力青枯雷尔氏菌对烟草根系土壤微生物脂肪酸生态学特性的影响［J］.植物病理学报，2013，43（5）：518-531.

［6］徐文联，曾艳.植物诱导抗病基因工程［J］.生物学通报，1996，31（1）：18-20.

［7］朱育菁，周涵韬，刘波，等.番茄青枯雷尔氏菌的强致病力与无致病力菌株生长竞争关系的研究［J］.厦门大学学报：自然科学版，2004，43（增刊）：97-101.

［8］郑继法，张建华，李连臣，等.烟草不同品种对青枯菌的抗性分析［J］.山东农业大学学报，1995，26（1）：23-29.

［9］肖永生，黎定军，袁俊鹏，等.对烟草青枯病苗期抗性鉴定接种方法的探讨［J］.湖南农业科学，2000（3）：39-40.

［10］彭细桥，周国生，邓正平，等.烟草青枯病内生拮抗菌的筛选、鉴定及其防效测定［J］.植物病理学报，2007，37（6）：670-674.

［11］吴蔼民，顾本康，傅正擎，等.内生菌73a在不同抗性品种棉花体内的定殖与消长动态研究［J］.植物病理学报，2001，31（4）：289-294.

［12］龙良鲲，肖崇刚.内生细菌01-144在番茄根茎内定殖的初步研究［J］.微生物学通报，2003，30（5）：53-56.

［13］李合生.植物生理生化实验原理与技术［M］.北京：高等教育出版社，2000.

［14］陈志谊，王玉环，殷尚智.水稻纹枯病抗性机制的研究［J］.中国农业科学，1992，25（4）：41-46.

［15］李靖，利容千，袁文静.黄瓜感染霜霉病菌叶片中一些酶活性的变化［J］.植物病理学报，1991，21（4）：277-282.

［16］江山，韩熹莱，郭雪柳.抗植物病毒剂对烟草和甜菜病程相关蛋白的诱导作用［J］.植物病理学报，1995，25（3）：243-246.

［17］Boller T H，Metraux J P.Extracellular localization of chitinase in cucumber［J］.Physiological and Molecular Plant Pathology，1988，33（1）：11-16.

［18］易龙.烟草内生与附生细菌互作对赤星病的控病及机理研究［D］.重庆：西南农业大学，2003：23-24.

［19］任欣正，张建华，方中达.无致病力产细菌素拮抗菌nQE-104在番茄植株上定殖能力的研究［J］.植物病理学报，1987，17（3）：129-133.

［20］Kelman A，Hartman G L，Hayward A C.Introduction in bacterial wilt：the disease and its causative agent Pseudomonassolanacearum［M］.California：Centre Agriculture Bioscience International Press，1994：1-7.

［21］肖田，肖崇刚，邹阳，等.青枯菌无致病力菌株对烟草青枯病的控病作用初步研究［J］.植物保护，2008，34（2）：79-82.

［22］杨宇红，刘俊平，杨翠荣.无致病力hrp-突变体防治茄科蔬菜青枯病［J］.植物保护学报，2008，35（5）：433-437.

责任编辑 董志坚

Control Effects of Avirulent Strain Tbw1-7-3 ofRalstonia Solanacearumon Tobacco Bacterial Wilt

CHEN Guokang,ZHOU Bangju,ZHOU Danni,XIAO Chonggang*,MA Guanhua,and DONG Guoju College of Plant Protection,Southwest University,Chongqing 400716,China

To further reveal the control mechanism of avirulent strains of Ralstonia solanacearum against tobacco bacterial wilt,biocontrol trials were conducted in a greenhouse and field plots.The colonization of drug-resistant mutant strains in tobacco plants was determined via drug resistance marker,and the changes of activities of enzymes PAL,POD,PPO in the treated tobacco plants were analyzed.The results showed that the relative control efficacy of avirulent strain Tbw1-7-3 against tobacco bacterial wilt was up to 89.4%in greenhouse.At the early stage（10-20 days）after disease occurrence,the control efficacy of Tbw1-7-3 was comparable to that of streptomycin in fields,its drug-resistant mutant strain Tbw1-7-3k could colonize on the surface of tobacco roots and in tobacco plants for a short duration.Meanwhile, Tbw1-7-3 promoted the activities of PAL,POD,PPO and the accumulation of pathogenesis-related protein（PRP）in hosts.Avirulent strains possessed better control efficacy against tobacco bacterial wilt, especially strain Tbw1-7-3.The field experiments also indicated that Tbw1-7-3 had good control efficacy at the early stage of disease occurrence.The antagonistic mechanism of avirulent strains against Ralstonia solanacearum might be the results of both position occupying and resistance inducing.

Tobacco bacterial wilt；Avirulent strain；Biological control；Antagonistic mechanism

S43

A

1002-0861（2015）11-0007-05

10.16135/j.issn1002-0861.20151102

2015-02-09

2015-06-12

重庆市烟草专卖局“重庆市烟草有害生物调查研究”（NY2010060103007）；西南大学学科团队建设项目“作物病虫害成灾机理及持续控制的基础研究”（2362015XK04）。

陈国康（1974—），博士，副教授，主要从事烟草病害生物防治、病害诊断与控制研究。E-mail：chenguokang@swu. edu.cn；*

肖崇刚，E-mail:chgxiao@swu.edu.cn

陈国康，周帮菊，周丹妮，等.无致病力青枯菌株对烟草青枯病的控制作用［J］.烟草科技，2015，48（11）：7-10，32. CHEN Guokang，ZHOU Bangju，ZHOU Danni，et al.Control effects of avirulent strain Tbw1-7-3 of Ralstonia solanacearum on tobacco bacterial wilt［J］.Tobacco Science&Technology，2015，48（11）：7-10，32.