生猪脓包化脓隐秘杆菌的分离鉴定与防控分析

刘晓波，李 淼，岑 静，李润成

（湖南农业大学动物医学院，湖南 长沙410128）

皮肤软组织化脓性感染是由于细菌侵入皮肤而发生的炎症反应，局部可出现红、肿、热、痛和功能障碍，严重时细菌及毒素进入血液循环可引起毒血症或败血症,伤口感染是细菌在体内大量繁殖的结果，脓是机体组织炎症过程中形成的浓稠或稀薄的渗出物，其中包含变性、坏死的白细胞、细菌、坏死组织碎片和渗出的组织液。为了解猪场内生猪体内外脓包形成原因，笔者从不同规模的猪场、采集生猪不同部位的脓包样本，进行细菌分离、鉴定，并将测出的分离菌16SrRNA 基因与GenBank 登录的序列进行Blast 比对分析。 意图对脓包形成的主要病原，进行调查分析，为猪场预防脓包形成提供科学的指导。

1 材料与方法

1.1 主要试剂

巧克力琼脂培养基购自江门市凯林贸易有限公司，DNA 聚合酶、DNTP 购自北京天根生物化学科技有限公司。

1.2 病料样本的采集

从不同猪场， 主要以保育猪和肥猪为采样对象，发现脓包首先进行临床观察并就脓包形成的原因向畜主展开调查，然后用一次性灭菌注射器无菌采取生猪体表脓包的脓汁样品或直接将有发脓灶的组织样品带回试验室备用。

1.3 细菌的分离培养与镜检

取采回的脓汁或带有发脓灶的病料组织划线接种巧克力培养基， 并放于37℃恒温箱培养36h后，挑取菌落革兰氏染色镜检。

1.4 分离菌16SrRNA基因的扩增与测序、Blast分析

参照文献[1]合成细菌16SrRNA 基因的通用引物， 然后以分离的细菌为模板进行16SrRNA PCR扩增，PCR 扩增方法按常规进行。 将PCR 产物送上海铂尚生物技术有限公司测序， 并将测出序列于NCBI 网站进行Blast 分析确定分离菌为何种细菌,最后将测出序列与GenBank 登录的相同细菌序列用DNASTAR 生物软件进行同源性比对，衡量测出序列与已登录序列的同源性。

2 结果

2.1 病料采集结果

从不同猪场， 主要以保育猪场和肥猪为采样对象，发现脓包首先进行临床观察并就脓包形成的原因向畜主展开调查，然后无菌采取生猪体表或体内脓包的脓汁样品带回试验室备用。结果从3 个猪场共采集了7 个不同来源的脓包样本， 其中颈部皮下脓包4个、耳朵脓包1 个、实质脏器发脓灶样本2 个。不同猪场临床观察及脓包形成原因调查情况如下。

2.1.1 猪场一：湖南省长沙县某猪场、猪场管理水平一般。保育猪健康水平较好，笔者前去调查采样时，120 头保育猪当中发现有1 头保育猪颈部皮下有一拳头大小的脓包（见图1）。 畜主反应脓包形成原因可能与接种口蹄疫疫苗有关。

2.1.2 猪场二：湖南省长沙县某猪场、猪场管理水平较差。 保育猪健康水平不理想，保育猪转到肥猪栏不久的架子猪，部分出现呼吸困难症状，神经症状，不能站立，发病死淘率在5%～10%左右。 笔者前去调查采样时，解剖了4 头转入肥猪栏不久的架子猪，发现有1 头猪的肝、脾脏组织有白色发脓灶（见图2、图3）。 畜主不清楚发脓灶形成的原因。

图2 架子猪肝脏发脓灶

图3 架子猪脾脏发脓灶

2.1.3 猪场三：湖南省衡阳市某猪场、猪场管理水平差。保育猪健康水平补理想，笔者前去调查采样时，200 头保育猪当中发现有22 头保育猪耳朵或颈部长有脓包（代表性图片见图4、图5）。 通过畜主反映，颈部皮下脓包形成可能与接种油乳剂细菌灭活疫苗有关，耳朵可能与转群后猪群打斗有关。

图4 保育猪耳朵脓包

图5 保育猪颈部脓包

2.2 细菌分离培养及镜检结果

取采回的脓汁或带有发脓灶的病料组织划线接种巧克力培养基，并放于37℃恒温箱培养36 小时后，挑取菌落革兰氏染色镜检。结果所有分离菌，菌落形态可分为2 种。 1 号菌在平皿上生长为圆形、光滑、表面凸起、灰白色、针尖状菌落，周围有融血的菌落；革兰氏染色阳性。 2 号菌在平皿上生长为圆形凸起，边缘整齐，表面光滑，湿润，不透明的菌落；革兰氏染色为阳性。猪场二、三采集样本分离菌均为1 号菌落形态的细菌，样本中细菌数量多而纯；从猪场一样本中分离的细菌主要为1 号菌落形态的细菌，同时还有少量2 号菌落形态的细菌。

2.3 分离菌16SrRNA基因PCR扩增及测序分析结果

将分离到的细菌进行PCR 扩增， 并将PCR 产物送上海铂尚生物技术有限公司进行测序，最后于NCBI 中进行Blast 比对分析，结果，1 号菌落形态的细菌为均化脓隐秘杆菌，与GenBank 登录的化脓隐秘杆菌序列基因同源性为96%以上（见图6，图中HN1、HN2、HN3、HN4、HN5、HN7、HN8：本文测出序列 ，HF947290、JN578122、JQ975944、JQ975947：GenBank 登录的化脓隐秘杆菌16SrRNA 基因序列）；2 号菌落形态的细菌为葡萄球菌， 与GenBank登录的葡萄球菌序列同源性达到99.9%（见图7，其中PT1： 本文测出序列，HM484984、HM484985、HM484986、NR036905：GenBank 登 录 的 葡 萄 球 菌16SrRNA 基因序列）。

图6 化脓隐秘杆菌与GenBank登录序列同源性比较结果

图7 葡萄菌与GenBank登录序列同源性比较结果

4 讨论与分析

4.1 病样采集

本文从湖南省的几个规模猪场调查采样，从几头保育猪的颈部脓包采集了4 个脓汁样品，从1 头猪肿大的耳朵采集了1 个脓包样品，从1 头保育猪的实质脏器采取了2 个化脓灶样品。结果除1 个颈部皮下浓汁样品同时分离到少量葡萄球菌外，所有样品均分离到纯的、数量众多的化脓隐秘杆菌。 所采样品数量虽比较少，但脓包产生的部位具有多样性， 基本上包括了生猪体内外常见脓包出现的部位。因此，本文分离细菌的结果具有一定的代表性，说明生猪体内外常见脓包与化脓隐秘杆菌感染有一定关联，这与国内相关报道具有一致性[2、3]，为生猪体内外脓包的防控补充了参考数据。

4.2 脓包的成因

化脓隐秘杆菌化脓隐秘杆菌又名化脓放线菌或化脓棒状杆菌， 为革兰染色阳性的短棒状杆菌，普遍存在于牛、羊、猪和其他重要经济动物的黏膜上，是一种条件性致病菌[2]。该病原最早从牛的脓汁中分离得到，常见于牛、羊、猪的化脓性病灶，表现为肺炎、关节炎、心内膜炎、皮下脓肿等[3]。化脓隐秘杆菌已被认定为病原菌, 并关于人感染致病病例也常有报道[5]。

本文从脓汁分离到化脓隐秘杆菌， 分离率为100%。 从本文调查的生猪颈部皮下脓包的形成原因来看， 其与接种油佐剂疫苗存在一定的关系，但猪舍不良的卫生条件以及较高的气温促进了脓包的形成， 化脓隐秘杆菌通过注射伤口进入生猪体内，加上白矿物油难以吸收、易造成组织损伤、无菌性肉芽肿，二因素结合可能促进了细菌性脓包的形成。 此外，从本文还可见，生猪合群时的打斗，造成生猪体表伤口也是生猪体表形成脓包的重要原因，至于本文采集到的实质脏器发脓灶样本可能是由于局部伤口化脓隐秘杆菌感染后，加上生猪免疫力低下，化脓隐秘杆菌在体内出现转移的缘故。

4.3 预防工作

我国养猪业集约化养殖模式日益扩大，但部分猪场养殖理念未能跟上科学养猪的要求，饲养管理比较粗放，日常操作消毒意识不强。如：一些猪场对于诊疗器械的消毒管理极为忽视，针头、注射器放在窗台上或裸放在其他地方， 甚至同杂物一同混放，多个病猪用一个针头等；小猪转群后，猪场管理没有考虑如何减少混群小猪的打斗程度，造成小猪体表出现多处伤口， 且猪舍环境差容易出现感染。因此，不少猪场的生猪常可见到体表或体内脓包的出现。 尤其是在气温较高，细菌滋生的夏季更为明显。 脓包的形成势必引起生猪生长速度下降，饲料报酬率降低，给养殖户带来不必要的损失。 所以笔者认为，猪场平常做好各项管理工作，减少和消除各种诱因，对预防本病有重要意义，特别是加强猪场内生猪伤口的预防、伤口的有效消毒以及改善猪舍内的环境，降低环境中的病原含量对生猪疾病的防控具有非常重要的意义。

[1]Run Cheng Li,Chao Ting Xiao,Xing Qian,et al.Occurrence of Streptococcus dysgalactiae subsp. equisimilis in Masked Palm Civet (Paguma larvata)[J].Journal of Animal and Veterinary Advances,2012,11(12):2020-2023.

[2]郭文洁,赵敬翠,刘耀川,等. 化脓隐秘杆菌毒力因子的研究进展[J]. 中国兽医杂志,2010,46(1)：52-53.

[3]鲁杏华,何世成,谈志祥,等.猪化脓隐秘杆菌的分离与鉴定[J].中国畜牧兽医,2009,36（5):3.

[4]Plamondon M,Martinez G,Raynal L,et al.A fatal case of A rcanobacterium pyogenes endocarditis in a man with no identified animal contact:case report and review of the literature .Eur J Clin Microbiol Infect Dis,2007,26(9):663-666.

[5]Takemi O,Tomoyuki S,Hideki K,et al.Hemo rrhagic necrotizing splenitis in a slaughter pig infected with Arcanobacterium species .Journal Veterinary Medicine Science,2007,69(4):449-453 .