Hsulf-1在肝癌细胞系中的作用及STAT3信号通路研究

龚星,蒋建霞

(1.湖北医药学院附属襄阳医院 肿瘤科，湖北 襄阳 441000；2.南京医科大学，江苏 南京 210000)



Hsulf-1在肝癌细胞系中的作用及STAT3信号通路研究

龚星1,蒋建霞2

(1.湖北医药学院附属襄阳医院 肿瘤科，湖北 襄阳 441000；2.南京医科大学，江苏 南京 210000)

目的 基于肝癌细胞中人硫酸酯酶-1(human sulfatase-1，Hsulf-1)基因对STAT3信号通路的影响，探讨Hsulf-1基因在肝癌发生发展中的作用。方法 应用RT-PCR 方法测定Hsulf-1在肝癌细胞中的表达；通过Western blot方法测定Huslf-1在HGF 加入前后对STAT3 磷酸化(p-STAT3)水平及下游蛋白的影响。结果 5-2′-脱氧胞苷(5-Aza-2′-deoxycytidine,5-Aza-dC和曲古抑菌素Actrichostain A,TSA)处理HepG2细胞中Hsulf-1表达增加，且2者具有协同作用；与正常细胞相比，Hsulf-1在肝癌细胞系中(HepG2，Hep3B， Huh-7，SMMC-7221)表达水平下降，在转染pcDNA3.1(+)/Hsulf-1以及pcDNA3.1(+)/STAT3siRNA-Hsulf-1中的HepG2细胞，Hsulf-1的蛋白表达量增加，p-STAT3和c-met的表达水平下降，在未转染组以及转染阴性siRNA的HepG2细胞中，结论则相反。结论 Hsulf-1在肝癌细胞中表达下降； Hsulf-1在肝癌细胞中可抑制由HGF刺激的p-STAT3及下游蛋白的表达水平。

Hsulf-1；肝癌细胞系；STAT3；信号通路

原发性癌是目前最常见的恶性肿瘤之一，尤其是在国内，其发病率仍居高不下，并有逐年上升的趋势。现阶段治疗主要采取手术方式，但治疗效果不是很理想。因此研究开发更为有效的诊断治疗手段尤为迫切，而在此基础上深入研究肝癌的发生发展的分子机制，由此通过分子水平上干预、阻断及逆转其癌变的过程，提高肝癌的预防、诊断和治疗水平在很大程度上已经得到人们的广泛重视，并将成为今后的基础[1-2]。在本研究旨在探讨在肝癌细胞中人硫酸酯酶-1(human sulfatase-1，Hsulf-1)基因是否会对信号传导子及转录激活子3(signal transducer and activator of transcription 3，STAT3)信号通路有调控的作用，肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor，HGF)能否介导STAT3信号通路的激活。研究将构建好的Hsulf-1和STAT3 siRNA转染至HepG2细胞中，用Western blot方法检测在不同条件下，其在HepG2细胞中的表达情况。采用的RNA干扰(RNA interference，RNAi)技术，经G418筛选形成了表达STAT3 siRNA的肝癌细胞，其STAT3 mRNA表达及蛋白下降，而且此类细胞增殖活性明显减弱，凋亡会增加，而无关序列的siRNA表达载体在对STAT3表达无影响，而且对于细胞增殖活性以及凋亡也无明显影响。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器 Trizol 试剂 (湖北贝特试剂公司)；结晶紫、 MTT 试剂盒、阳离子脂质体(Lipofectin)、DMSO(Sigma，USA)；胎牛血清 (Hyclone，USA)；硝酸纤维膜(Millipore，USA)；DNA marker、 protein marker、RNA 、PCR KIT(AMV)Ver.3.0 试剂盒(TaKaRa 生物公司，日本)BCA 试剂盒(北京百泰克公司)；RIPA 强裂解液、ECL 试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司)，Hsulf-1、p-STAT3、STAT3、PI Sigma、cyclinD1、p-c-met、bcl-2 抗体均(SANTA CRUZ 公司，USA)；脱脂奶粉(上海光明乳业)；羊抗鼠二抗(KPL公司，USA)；Taq 酶(上海生工生物技术服务有限公司)，24 孔transwell平板(corning公司，USA)；Qiagen Mid Plasmid Purification kit (Qiagen公司，德国)；紫外分光光度计(Beckman公司，USA)；超纯水机(SG 公司，德国)；细胞培养箱 (力康生物医疗科技控股集团)；微量加样器 (Eppendorf，Germany)Heraeus CO2细胞培养箱( Thermo FORMA 公司)；YXQG01 型高压灭菌锅(山东新华医疗器械厂)；FM130 型雪花制冰器(宁波格兰特公司)；自动电热压力蒸汽灭菌器(上海申安医疗器械厂)；电热恒温鼓风干燥箱(上海精宏实验设备有限公司)；紫外可见光分光光度计、台式微量冷冻离心机、流式细胞仪500(Beckman Coulter 公司，USA)；PTC-200 Peltier Thermal Cycler (MJ Research 公司，USA)；WD-9405B 型水平摇床、DYY-6C 型、7C 型电泳仪、DYCP-31B 型迷你水平电泳槽 (北京市六一仪器厂)；电动震荡混合器、CS.24 型摇床(上海医疗设备厂)；PCR 扩增仪(480 型)(BIO.RAD 公司，USA)；高速多功能冷冻离心机(JOUAN公司，法国)；恒温搅拌循环水浴箱(常州国华电器有限公司)；Alpha imagerTM1220 型紫外成像分析仪(Alpha innotech 公司，USA)。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞培养：肝癌细胞系(HepG2，Hep3B，Huh-7及SMMC-7221)培养于含10%新生牛血清的DMEM中，培养条件为37 ℃、5%CO2。根据细胞的生长情况，及时更换培养液，在细胞贴壁生长达到培养板面积的80%～90%时，可以进行传代，在此期间，根据细胞生长速度选择1:2～1:4传代。用1 mL胰酶消化液在超净工作台上使用，消化大约2 min，当细胞变圆后，再加入2 mL的无血清培养液，继续用弯头吹管将其充分吹打成单细胞的悬液后，再加入1 mL新生牛血清来终止胰酶的作用，最后按照传代的要求加入5 mL带血清培养液，分装到新培养瓶里继续培养，做好传代标记。

1.2.2 5-Aza-dC及TSA处理HepG2细胞：将取对数生长期HepG2细胞，经胰酶消化后调整细胞密度为1×106个/mL以每孔100 μL接种于96孔培养板中，待细胞贴壁后其中3个随机分为5-Aza-dC组，分别加入浓度为5、2.5、1.0、0.5和0 μmol/L 5-Aza-dC；对照组只加培养基、LO2细胞系细胞，每组设6个复孔，另3个随机分为5-Aza-dC、对照组和5-Aza-dC+TSA组分别加入浓度分别为0.5，0.25，0 μmol/L的TSA，和5.0 μmol/L 5-Aza-dC+0.5 μmol/L TSA组，对照组只加培养基、LO2细胞系细胞，每组设6个复孔。

1.2.3 RT-PCR 检测Hsulf-1 mRNA的表达：总RNA提取：按照试剂盒说明书操作步骤提取肝癌细胞系的RNA;(逆转录获得cDNA；引物设计与合成；PCR反应。

1.2.4 pcDNA3.1(+)/Hsulf-1、pcDNA3.1(+)/STAT3siRNA及pcDNA3.1(+)/STAT3siRNA-Hsulf-1真核表达载体的构建 以 pcDNA3.1(+)为模板，以目的基因Hsulf-1引物扩增 Hsulf-1 cDNA，反应条件: 94 ℃ 变性 2 min；94 ℃ 30 s；56 ℃ 30 s；72 ℃ 60 s，35 个循环; 72 ℃延伸5 min。PCR产物行BamHⅠ+SalⅠ双酶切，插入到质粒载体 pcDNA3.1的多克隆位点区，构建pcDNA3.1(+)/Hsulf-1。

1.2.5 SDS-PAGE电泳：收集细胞按1×107个/mL加入RIPA细胞裂解液，BCA法测蛋白浓度。按每孔蛋白上样总量为20 μg制备样品，十二烷基硫酸钠(SDS)聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，半干式电转印至PVDF膜上，按Western blot常规操作行Hsulf-1蛋白和p-STAT3蛋白检测，X光片用Mixrotek ScanWizard5扫描软件进行电脑扫描、Quantity one 7.0图像分析软件作灰度分析。

1.2.6 HGF处理HepG2细胞：将取对数生长期HepG2细胞，经胰酶消化后调整细胞密度为1×106个/mL以每孔100 μL接种于96孔培养板中，待细胞贴壁后其中随机分为加入浓度分别为5 ng/mL HGF，对照组只加培养基、细胞，每组设6个复孔，在不同时间段(0，1 h)观察并检测其蛋白表达情况。

2 结果

2.1 通过5-aza-dC及TSA处理HepG2细胞后Hsulf-1的表达 当研究将不同浓度的5-aza-dC 加入到HepG2细胞后，Hsulf-1随着药物浓度的增加而表达上升，同样的结果出现在加入TSA后，TSA浓度的增加使得Hsulf-1的表达同样上升，将5.0 μmol/L 5-aza-dC以及0.5 μmol/L TSA同时加入到HepG2细胞后，Hsulf-1的表达量较前2者单独的效果更高。见图1。

图1 5-aza-dC及TSA处理HepG2细胞后Hsulf-1的表达Fig.1 The expression of Hsulf-1in HepG2 cells treated by TSA and 5-aza-dC

分别将0、0.5、1.0、2.5、5.0 μmol/L 5-aza-dC加入到HepG2细胞后，Hsulf-1 表达量随药物浓度增加而提高；将0、0.25、0.5 μmol/L TSA加入到HepG2细胞得到同样的结果，而同时加入5.0 μmol/L 5-aza-dC以及0.5 μmol/L TSA后，Hsulf-1表达量分别与前2者单独处理后更高。

2.2 RT-PCR 检测Hsulf-1 基因mRNA的表达结果 应用RT-PCR方法，在所测的4种肝癌细胞系中(HepG2、Hep3B、Huh-7及SMMC-7221)，Hsulf-1基因mRNA的表达水平全部下降，且下降明显，以正常肝细胞作为对比。这与前期他人在肝癌细胞系中的研究结果相同[3]。Hsulf-1 mRNA的表达量用所测肝癌细胞系及正常肝细胞LO2细胞系中的mRNA的灰度值与内参照GAPDH的灰度值做比值进行表示。见图2。

图2 RT-PCR方法检测肝癌细胞系、对照组中Hsulf-1 mRNA的表达情况*P< 0.05，与对照组相比Fig.2 Expression of Hsulf-1mRNA in hepatocellular carcinoma cell line and the control group detected by RJ-pck*P< 0.05，compared with control group

2.3 Western blot检测转染Hsulf-1蛋白以及p-STAT3蛋白 研究成功转染pcDNA3.1(+)/Hsulf-1、pcDNA3.1(+)/STAT3 siRNA及pcDNA3.1(+)/STAT3 siRNA-Hsulf-1，并应用Western blot分析检测。在未转染组以及转染空质粒的HepG2细胞中，Hsulf-1的表达受到抑制，没有呈现高表达状态，而转染pcDNA3.1(+)/Hsulf-1以及pcDNA3.1(+)/STAT3 siRNA-Hsulf-1后的HepG2细胞中，Hsulf-1的蛋白表达量增加，检测STAT3磷酸化表达在转染细胞中的情况，在未转染组以及转染阴性siRNA的HepG2细胞中，STAT3 磷酸化的表达未受影响，呈现高表达，而在pcDNA3.1(+)/STAT3siRNA以及pcDNA3.1(+)/STAT3siRNA-Hsulf-1后的HepG2细胞中，STAT3磷酸化表达下降，结果表明转染成功。见图3。

图3 Western blotting检测 Huslf-1表达质粒及STAT3 siRNA转染情况Fig.3 The method of western blot for detection the expression of Hsulf-1 in and transfection conditions of STAT3 siRNA

2.4 Hsulf-1在HepG2细胞系中抑制STAT3 磷酸化的表达水平 在HepG2细胞系中，Hsulf-1的表达可减少STAT3磷酸的表达水平，与对照组相比，差异有统计学意义(P<0.01)，但是却不影响STAT3总量。将HGF 加入到HepG2 非表达Hsulf-1细胞系中，研究发现p-STAT3及c-met的表达水平同时上升，但是如将HGF 加入到在HepG2 表达Hsulf-1细胞系中，则结果完全不同，STAT3及c-met的磷酸化表达水平开始得到抑制。见图4。

图4 Hsulf-1在HepG2细胞系中对STAT3 信号的影响*p<0.05,与对照组相比Fig.4 The effect of Hsulf-1 on STAT3 signal in HepG2 cell line*p<0.05,compared with control group

当成功转染Hsulf-1后，应用Western blotting 检测p-STAT3及总STAT3蛋白的表达情况，并与对照组定量分析p-STAT3蛋白含量，以p-STAT3/β-actin 作为比值进行分析，差异有统计学意义(P<0.01)；在HepG2 非表达Hsulf-1细胞系中加入5 ng/mL HGF 1 h后，p-c-met及p-STAT3的表达均随时间增加，而在Hsulf-1-转染细胞系中，2者的含量同时减少。

3 讨论

由研究可知，Hsulf-1在肝癌细胞系中呈现低表达状态，质粒转染后可促进 Hsulf-1蛋白表达升高，Hsulf-1可能通过降低 HSPGs的硫酸化程度，影响酪氨酸激酶活性，进一步抑制了多种信号通路的表达，肿瘤细胞出现增殖减慢、凋亡增加、侵袭性降低等有关，这与前期的研究相符，研究证实，Hsulf-1 参与调控多种细胞因子信号通路的表达。Liu等[12]将携带 Hsulf-1 片段的病毒转染肺癌细胞株 H292，发现 AKT、ERT 信号途径的表达下调，细胞迁移、增殖能力下降。研究证实[3]在肝癌细胞株研究中也发现，Hsulf-1的过表达可以使AKT、ERT的磷酸化水平降低，抑制该通路的表达。而Hsulf-1在多项研究中也表明可以通过水解HSPGS来调控多种信号通路，如MAPK 信号以及PI3K/AKT信号[4-6]等，但是目前尚未见报道Hsulf-1是否对STAT3信号通路有影响，为了进一步研究STAT3信号通路在HepG2细胞中的影响，研究构建了pcDNA3.1(+)/Hsulf-1 、pcDNA3.1(+)/STAT3 siRNA及pcDNA3.1(+)/STAT3 siRNA-Hsulf-1，并将其转入到HepG2细胞中，取名为Hsulf-1转染组，STAT3 siRNA组以及Hsulf-1转染+STAT3 siRNA组，本研究结果证实，Hsulf-1的表达可减少STAT3磷酸的表达水平，HGF可以促进非表达Hsulf-1细胞系中p-STAT3及c-met的表达水平上升，而在表达Hsulf-1细胞系中得到抑制。目前研究发现[7-10]STAT3信号转导通路是一类十分重要的信号通路，可调控细胞增殖、分化及凋亡等等的过程，其被激活的途径目前有两种，其中一种是在由细胞外的各种刺激信号，比较常见的是细胞因子IFN，IL-6等，它们会与细胞表面的相应受体进行结合，接下来进一步在细胞表面进行聚集并激活。但是由于缺乏内源性酪氨酸激酶活性，胞浆内的酪氨酸激酶的家族就会相应的被募集，比如说JAK家族[11-13]。JAK家族包括JAKl，JAK2及JAK3等，它们每个可激活的受体种类不同。在配体与受体结合后，并且受体通过募集其相应的JAK在磷酸化后，受体尾部的酪氨酸磷酸化。然后其与SH2结构域之间产生反应，并且STAT3激活。

而STAT3被募集后，它们会被磷酸化，接着就会形成二聚体，然后迅速进入核内，通过与其靶基因上的DNA进行结合，诱导基因转录。而另外有一个STAT3的激活途径，这种途径与细胞因子受体信号不同，活化生长因子受体也具有内源性的酪氨酸激酶活性，可以将STAT3进行磷酸化。比如有研究证实[14-15]EGFR可以将STAT3蛋白磷酸化[16]。不仅如此，一些其他的酪氨酸激酶如Src，Abl也可以将STAT3蛋白磷酸化。因此，STAT3蛋白可以被多种不同酪氨酸激酶激活。而STAT3可以稳定长期的表达此种效应，从而调控细胞生理功能。

外源性Hsulf-1基因能够抑制肝癌细胞系中呈现低表达状态，向肿瘤细胞中导入Hsulf-1基因会减少STAT3磷酸的表达水平，抑制其下游p-STAT3及c-met的表达水平，可以抑制肿瘤细胞生长和转移，促进肿瘤细胞凋亡。因此采用靶向Hsulf-1基因的治疗策略，能同时抑制肿瘤细胞的增殖与迁移，在一定程度上遏制了肿瘤无限制生长。由此可见，Hsulf-1基因作为一个很有潜力的抗癌基因，为临床上肿瘤的基因治疗提供了新的分子靶标。

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(编校：王冬梅)

Role of Hsulf-1 in hepatocellular carcinoma cell lines and STAT3 signaling pathway research

GONG Xing1,JIANG Jian-xia2

(1.Department of Oncology, Affiliated Xiangyang Hospital of Hubei Medical College, Xiangyang 441000, China; 2.Nanjing Medical University, Nanjing 210000, China)

ObjectiveTo investigate the role of Hsulf-1 gene in the occurrence and development of hepatocellular carcinoma based on effect of Hsulf-1 gene on STAT3 signaling pathway.MethodsRT-PCR method was used for determination of the expression of Hsulf-1 in hepatocellular carcinoma cells; Determination of Huslf-1 in HGF before and after adding on the phosphorylation of STAT3 by Western blot method (p-STAT3) level and the effect of downstream proteins.ResultsExpression of Hsulf-1 was increased by 5-Aza-dC and TSA treatment in HepG2 cells, which had synergistic effect.Compared with normal cells, expression levels of Hsulf-1 in HCC cell lines decreased(HepG2,Hep3B,Huh-7,SMMC-7221),but in the transfected, pcDNA3.1 (+) /Hsulf-1 and pcDNA3.1 (+) /STAT3siRNA-Hsulf-1 in HepG2 cells which was increased in expression of Hsulf-1 protein,the expression level of p-STAT3 and c-Met decreased in untransfected and transfected, siRNA negative HepG2 cells, while the opposite. ConclusionThe expression of Hsulf-1 decreased in HCC cells; Hsulf-1 can inhibit the expression of p-STAT3 and downstream protein level by stimulation of HGF in hepatocellular cancer cells.

human sulfatase-1; hepatocellular carcinoma; STAT3; signaling pathway

国家自然科学基金(81101800)

龚星，男，学士，主治医师，研究方向：肺癌的生物靶向治疗，E-mail：qch1821460052.com。

R735.7

A

1005-1678(2015)02-0048-04