正交试验优选归芪益气养血合剂的水煎工艺

祁俊，朱应成，刘亮镜，朱和平，潘扬

(1.安徽省芜湖市中医医院 制剂室，安徽 芜湖 241000；2.南京中医药大学 药用菌与中药生物技术研究所，江苏 南京 210023)



正交试验优选归芪益气养血合剂的水煎工艺

祁俊1，朱应成1，刘亮镜1，朱和平1，潘扬2Δ

(1.安徽省芜湖市中医医院 制剂室，安徽 芜湖 241000；2.南京中医药大学 药用菌与中药生物技术研究所，江苏 南京 210023)

目的 建立测定归芪益气养血合剂中黄芪甲苷含量的超高效液相色谱-蒸发光散射(ultra-high performance liquid chromatography-evaporative light scattering detector，UPLC-ELSD)法，以浸膏得率、黄芪甲苷和芍药苷含量的综合评分为指标优选制剂的最佳水煎工艺。方法 UPLC-ELSD法测定制剂中黄芪甲苷含量的条件如下，色谱柱：Waters Acquity UPLC BEH C18柱(2.1 mm× 50 mm，1.7 μm)；流动相：乙腈-水(35:65)；流速：0.3 mL/min；柱温：30 ℃；ELSD参数：漂移管温度=60 ℃，雾化气体(N2)流速=2.0 L/min。芍药苷的含量测定采用前期研究建立的HPLC测定方法。以浸膏得率、黄芪甲苷和芍药苷含量的综合评分为指标，通过正交试验考察加水量(A)、提取时间(B)、提取次数(C)对水煎工艺的影响。结果 UPLC-ELSD测定黄芪甲苷方法线性关系良好(r=0.9999)，平均加样回收率为103.0%，并具有良好的精密度、专属性和重现性。水煎工艺的正交试验结果表明，影响提取效果的因素主次顺序依次为：提取次数>加水量>提取时间，且方差分析表明提取次数对实验结果影响显著(P<0.05)。归芪益气养血合剂的最佳水煎工艺为：每次加水8倍量，水煎2次，总提取时间1.5 h。结论 优化的水煎工艺具有可操作性、稳定性好，适用于产业化生产。

归芪益气养血合剂；正交试验；水煎工艺；黄芪甲苷；芍药苷

归芪益气养血合剂来源于临床经验方，为中医名方“补阳还五汤”加减变化而来，由黄芪、当归、赤芍、川芎、甘草、桑寄生等药味组成，具有补气活血、养血通络的功效，安徽省芜湖市中医医院长期以来用于气虚血瘀型中风恢复期及后遗症期的康复及治疗，发现其较单纯使用西药疗效更好，且在治疗过程中未发现不良反应[1]。中药合剂是在汤剂的基础上改进和发展起来的中药剂型，其最大限度地保留了传统汤剂吸收快、奏效迅速的优势；且可大量生产，免去临用煎药的麻烦，应用方便。中药合剂的工艺流程一般为：浸提→净化→浓缩→分装→灭菌等，其中浸提操作一般按汤剂的水煎方法进行，是合剂制备工艺中最关键的生产步骤[2]。本实验首次采用超高效液相色谱-蒸发光散射(ultra-high performance liquid chromatography-evaporative light scattering detector，UPLC-ELSD)法测定归芪益气养血合剂中黄芪甲苷的含量；并以芍药苷、黄芪甲苷含量和浸膏得率的综合评分为指标，通过正交试验考察加水量、提取时间、提取次数对水煎工艺的影响，确定归芪益气养血合剂的最佳水煎工艺。

1 材料与方法

1.1 材料 高效液相色谱仪(Acquity UPLC-ELSD，美国Waters公司)；AL-204型万分之一电子天平，XP-205型十万分之一电子天平[梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司]。归芪益气养血处方为黄芪、当归、赤芍、川芎、地龙、鸡血藤、红花、甘草、桑寄生、牛膝、盐杜仲、续断，药材均由安徽井泉集团中药饮片有限公司提供，经芜湖市中医医院药剂科主任徐斌副主任中药师鉴定，均符合2010年版《中国药典》一部相关项下要求；其中，黄芪、当归分别为豆科植物膜荚黄芪Astragalusmembranaceus(Fisch.)和伞形科植物当归Angelicasinensis(Oliv.) Diels的干燥根，其中黄芪为蜜制品。芍药苷对照品(中国药品生物制品检定所，批号：110736-201337，经HPLC归一化法测定其纯度94.9%)；黄芪甲苷对照品(中国药品生物制品检定所，批号：110781-201314，经HPLC归一化法测定其纯度95.8%。乙腈(色谱级，美国TEDIA公司)；HPLC用水为“娃哈哈”纯净水；其他试剂均为分析纯。

1.2 方法

1.2.1 水煎提取：按归芪益气养血方处方量称取黄芪、赤芍及其它各味药材共800 g，加水煎煮，6层纱布滤过，合并滤液，浓缩并加蒸馏水至1 000 mL(每mL含生药量0.8 g)，作为供试品母液。

1.2.2 黄芪甲苷的含量测定：黄芪甲苷作为归芪益气养血方中君药黄芪的活性成分，是其质量控制的主要指标，具有调节机体免疫力、保护组织器官、降低血糖、抗细胞凋亡和抗炎抗病毒等多方面的药理作用[3]。有关黄芪甲苷含量测定的方法很多，目前常用的主要是液相色谱的方法，有HPLC-ELSD(蒸发光散射检测器)[4]、HPLC-UV(紫外可见光检测器)[5]、HPLC-RI(示差检测器)[6]和HPLC-MS[7]等方法。其中，HPLC-MS虽然有较高的准确性和灵敏度，但使用仪器昂贵，操作复杂，故不适合常规质量分析。目前UPLC-ELSD[8-9]法是较为常用的黄芪甲苷的测定方法。UPLC是以1.7 μm的超细色谱柱填料为核心技术的新型色谱分离分析技术，相对于中药常规HPLC而言，UPLC有更好的分离效率及灵敏度[10]。参考黄芪甲苷的《中国药典》[11]及文献[8-9]UPLC-ELSD含量测定，本研究对流动相加以改进，首次建立了适合归芪益气养血合剂中黄芪甲苷含量测定的UPLC-ELSD法。

① 色谱条件：Acquity H-Class UPLC超高效液相色谱仪，包括四元梯泵、自动进样器、柱温箱、蒸发光散射检测器(ELSD)以及Empower 3色谱工作站(美国Waters公司)；色谱柱：Waters Acquity BEH C18(2.1 mm× 50 mm，1.7 μm)；流动相：乙腈-水(35:65)，流速：0.3 mL/min；进样量：2 μL；柱温：30 ℃。理论板数按黄芪甲苷峰计算应不低于4000；

② ELSD参数的选择：雾化气体流速和漂移管温度是影响蒸发光散射检测器响应的2个基本参数，实验过程中对这2个参数进行了选择，同时对比了分流和不分流2种模式；

雾化气流速对响应灵敏度有影响。实验考察了1.0、2.0和3.0 L/min 3个流速水平，发现在固定漂移管温度和分流模式前提下，噪声响应随雾化气流速变小而变大；但当雾化气流速增大到一定程度时，待测成分响应信号又有较大程度降低。经过对比优化，最后确定采用2.0 L/min的雾化气体流速；

漂移管温度在本实验中会较大程度的影响检测信号响应。实验考察了50 ℃、60 ℃、70 ℃ 3个温度水平的检出限(S/N=3为基准)。结果表明，检出限在60 ℃温度下最低，可能是由于50 ℃温度下溶剂挥发不完全会造成较大的背景噪声，而温度70 ℃时待测成分又部分挥发而使有效响应信号降低，因此最终确定采用60 ℃的漂移管温度。

对比分流和不分流2种模式，发现在分流情况下检测灵敏度较低，最后确定使用不分流模式。

最终确定的ELSD参数：漂移管温度：60 ℃，雾化气体(N2)流速：2 L/min；

③ 对照品溶液的制备：精密称取黄芪甲苷对照品18 mg(精确至0.00 mg)，置50 mL容量瓶中，加入甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，得浓度为360 μg/mL的对照品贮备液，备用。精密吸取对照品贮备液1 mL至5 mL容量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，制得浓度为72 μg/mL的对照品溶液；

④ 供试品溶液的制备：精密量取“1.2.1”项下供试品母液25 mL，分别置于分液漏斗中，用水饱和正丁醇萃取4次(50 mL/次)，合并正丁醇液，用氨试液充分洗涤2次(50 mL/次)，弃去氨液，正丁醇液蒸干，残渣加甲醇溶解，转移至10 mL容量瓶，加甲醇稀释并定容至刻度，摇匀，经0.22 μm微孔滤膜滤过，取续滤液即得供试品溶液；

⑤ 专属性试验：根据处方称取除黄芪外的其他几味药材，按“1.2.1”项下方法制成不含黄芪的空白对照样品，再按“1.2.2④”项下方法制成空白对照溶液。分别精密吸取对照品溶液、供试品溶液和空白对照溶液，按“1.2.2①”项下色谱条件注入超高效液相色谱仪，记录UPLC色谱图；

⑥ 线性关系的考察：分别精密吸取黄芪甲苷(360 μg/mL)对照品贮备液0.5、1、2、3、4、5 mL，置于5 mL容量瓶中，加(或不加)甲醇至刻度，摇匀，制得浓度分别为36、72、144、216、288、360 μg/mL的对照品溶液，按“1.2.2①”项下色谱条件分别进样2 μL，测定其峰面积。以对照品溶液浓度(μg/mL)的常用对数为横坐标X，以黄芪甲苷峰面积(A)的常用对数为纵坐标Y，绘制曲线；

⑦ 精密度试验：精密吸取“1.2.2③”项下对照品溶液2 μL，按“1.2.2①”项下色谱条件连续进样6次，测定黄芪甲苷峰面积值；

⑧ 日内精密度试验：精密吸取“1.2.2③”项下对照品溶液2 μL，按“1.2.2①”项下色谱条件分别于0、2、4、6、8、10 h进样1次，测定黄芪甲苷峰面积值；

⑨ 重复性试验：平行称取“1.2.1”项下浸膏适量(含生药量10 g)6份，分别按“1.2.2④”项下方法制备供试品溶液，并按“1.2.2①”项下色谱条件进行测定并计算；

⑩ 加样回收率试验：精密量取“1.2.1”项下供试品母液12.5 mL，平行6份，分别精密加入360 μg/mL的黄芪甲苷对照品溶液1.8 mL× 2，2.4 mL× 2以及3.0 mL× 2，加蒸馏水稀释至25 mL，按“1.2.2④”项下方法制备供试品溶液，按“1.2.2①”项下色谱条件进行测定，并计算加样回收率；

1.2.3 芍药苷的含量测定：按照前期研究建立的归芪益气养血合剂中芍药苷含量的HPLC测定方法[12]。

① 芍药苷色谱条件：高效液相色谱仪同“1.2.2①”项下；色谱柱：Agilent ZORBAX SB-C18(4.6 mm× 150 mm，5 μm)；流动相：乙腈-0.1%磷酸(14:86)，流速：1 mL/min；进样量10 μL；柱温：30 ℃；检测波长：230 nm。理论板数按芍药苷峰计算应不低于2000；

② 对照品溶液的制备：精密称取芍药苷对照品10.1 mg(精确至0.00 mg)，置50 mL容量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，得浓度为202 μg/mL的芍药苷对照品贮备液。精密吸取芍药苷对照品贮备液2 mL至5 mL容量瓶中，加水至刻度，摇匀，制得浓度为80.8 μg/mL的芍药苷对照品溶液；

③ 供试品溶液的制备：精密量取“1.2.1”项下供试品母液5 mL至50 mL容量瓶，加水稀释并定容至刻度，摇匀，经0.45 μm微孔滤膜滤过，取续滤液即得供试品溶液。

1.2.4 正交试验因素及水平设计：影响中药合剂浸提工艺的主要因素包括加水量(A)、提取时间(B)和提取次数(C)，在单因素试验的基础上，以上每个因素设定成3个水平，因素和水平见表1，其中B和C的相关性设计见表2。由于中药成分复杂，为避免单一指标进行工艺优化时产生偏差，保持本方的特点，最大程度发挥中药制剂的复方功效，多指标有效控制该制剂的质量，以浸膏得率、黄芪甲苷和芍药苷的含量的综合评分为指标，采用L9(34)正交试验设计[13]优选归芪益气养血合剂的水煎工艺。

表1 归芪益气养血合剂水煎工艺的因素和水平

表2 水煎工艺提取时间和提取次数的分配关系

1.2.5 测定结果的计算与分析：① 浸膏得率的测定：精密量取“1.2.1”项下供试品母液25 mL，平行3份，置于干燥至恒重的蒸发皿中，水浴蒸干后于105 ℃干燥3 h，干燥器中冷却30 min，迅速称定质量(精确至0.0000 g)。

浸膏得率(%)=浸膏得量(g)/[25( mL)× 0.8(g/ mL)]×100；

② 加权综合评分的获得：采用综合评分加权法对归芪益气养血合剂的水煎工艺进行评价，根据各指标成分在工艺选择中的主次地位给予不同的加权系数，其中黄芪甲苷、芍药苷为本制剂主要的有效成分指标，权重系数均为0.4；浸膏得率是饮片的溶出行为指标，权重系数为0.2，综合评分为3者分别权重积分之和。

黄芪甲苷相对含量(%)=各实验黄芪甲苷含量/最高含量×100；

芍药苷相对含量(%)=各实验芍药苷含量/最高含量×100；

相对浸膏得率(%)=各实验浸膏得率/最高得率×100；

综合评分(%)=(黄芪甲苷相对含量×0.4+芍药苷相对含量×0.4+相对浸膏得率×0.2)

1.2.6 验证试验：按归芪益气养血方处方量放大100倍生产，称取黄芪、赤芍及其它各味药材共80 kg，平行3份，按上述确定的最佳水煎工艺条件进行提取、验证。

1.3 统计学方法 采用SPSS 13.0统计学软件进行实验数据分析，综合评分结果采用单因素方差分析，以P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 黄芪甲苷含量的UPLC-ELSD检测考察结果

2.1.1 专属性试验结果：由图1可知，在此色谱条件下，供试品溶液中黄芪甲苷色谱峰与黄芪甲苷对照品色谱峰保留时间一致，并与其他共存化学成分分离度大于1.5，基本达到基线分离；且空白对照溶液在相应的位置无色谱峰干扰。

图1 专属性试验超高效液相色谱图A：对照品溶液；B：供试品溶液；C：空白对照溶液；1：黄芪甲苷峰Fig.1 UPLC chromatograms of specificity testA: sample solution; B: standard solution; C: blank; 1：astragaloside peak

2.1.2 线性关系的考察结果：以对照品溶液浓度(μg/mL)的常用对数为横坐标X，以黄芪甲苷峰面积(A)的常用对数为纵坐标Y，得对数方程为Y=1.7497X+0.2278，r=0.9999。该结果表明，黄芪甲苷在36～360 μg/mL的浓度范围内，与峰面积呈良好的线性关系。

2.1.3 精密度试验结果：连续测定所得黄芪甲苷峰面积的RSD为1.9%(n=6)，提示该测定方法精密度良好。

2.1.4 日内精密度试验结果： 10 h内所得黄芪甲苷的RSD为4.3%，提示在10 h内供试品基本稳定。

2.1.5 重复性试验结果：黄芪甲苷的平均含量为68.3 μg/mL，RSD为2.1%，提示该方法重复性良好。

2.1.6 加样回收率试验结果：黄芪甲苷平均加样回收率为103.0%，RSD为3.0%。

2.2 正交试验测定结果 由表3的正交试验直观分析结果可见，归芪益气养血合剂的最佳水煎工艺条件为：A2B2C2，即每次加水8倍量，煎煮2次，煎煮时间为1.5 h。由表4综合评分的方差分析可以看出，影响综合评分因素的排序为：C>A>B。较主要的因素是C，其次是A和B。其中，A、B因素相对误差(D)而言，对水煎工艺并无显著性影响；C因素对试验结果则有显著性影响。

表3 归芪益气养血合剂水煎工艺正交试验分析

表4 综合评分的方差分析

2.3 验证试验结果 水提取液(含生药0.8 g/mL)中黄芪甲苷、芍药苷的平均含量分别为71.4、720.6 μg/mL，RSD分别为1.7%、1.9%；浸膏得率平均为19.6%，RSD为1.2%；综合评分97.3分，接近于满分。提示优化的水煎工艺具有可操作性、稳定性好，适用于产业化生产。

3 讨论

首次建立了适合归芪益气养血合剂中黄芪甲苷含量测定的高效、快速的UPLC-ELSD方法，其谱峰的保留时间全部在3 min内，极大地缩短分析时间，提高分析效率及色谱峰分离度，减少溶剂损耗及废液处置费用，为高效、快速地监控归芪益气养血合剂质量提供了方法。

黄芪甲苷属于无紫外吸收或仅存在紫外末端吸收的物质，不能采用UV检测器检测。所以，在没有大大损失检测灵敏度、可以满足定性和定量要求的基础上，选用中等灵敏度的通用型检测器ELSD分析复杂中药复方体系，是一种很好的替代方式。ELSD不受成分是否有紫外吸收或紫外吸收值差异的影响，且受共存物质干扰少，基线平稳。

中药制剂的疗效是多种活性成分共同作用的结果，仅对其中的一个或几个成分加以控制，难以全面把握制剂的质量、疗效和稳定性。本试验采用正交试验法，以黄芪甲苷、芍药苷和浸膏得率等多指标综合评定，对归芪益气养血合剂的水煎提取工艺进行了优选，确定最佳工艺参数，即每次加水量为8倍，煎煮2次，煎煮时间为1.5 h，并进行了放大验证试验，进一步说明优化的水煎工艺具有可操作性、稳定性好，适用于产业化生产。

中药复方制剂水煎工艺考察除了应该对多种理化指标的综合提取效果进行评价外，必要时还要结合药理药效学评价，才能充分保证水煎工艺的可靠性和临床药效。

本制剂的药材在进行水煎煮提取前应浸泡约2 h，使其吸水完全，组织浸润疏松，有利于有效成分的溶出，否则，药材中的淀粉、蛋白质等受热凝固，阻碍有效成分的溶出。

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(编校：王俨俨)

Optimization of water decoction process for Guiqi Yiqi Yangxue Mixture by orthogonal test

QI Jun1, ZHU Ying-cheng1, LIU Liang-jing1, ZHU He-ping1, PAN Yang2Δ

(1.Department of Pharmaceutical Preparation, Wuhu Hospital of Traditional Chinese Medicine, Wuhu 241000, China; 2.Medical Fungi and PhytoBiotech Laboratory in Nanjing University of Chinese Medicine, Nanjing 210023, China)

ObjectiveTo establish ultra-high performance liquid chromatography-evaporative light scattering detector (UPLC-ELSD) method to determine the content of astragaloside in Guiqi Yiqi Yangxue Mixture and optimize the best water decoction process of the mixture.MethodsThe UPLC-ELSD conditions to determine the content of astragaloside in the mixture were as follow.The method was carried out on a Waters Acquity UPLC BEH C18column (2.1 mm× 50 mm,1.7 μm) by using acetonitrile-water (35:65) as mobile phase, and the flow rate was 0.3 mL/min and the column temperature 30 ℃.The parameter of ELSD: the drift tube temperature was set at 60 ℃, and the gas flow rate of N22.0 L/min.The content of paeoniflorin in the mixture was detected by previously established HPLC method.The orthogonal test was designed to optimize the water decoction process of the amount of water (A), decoction time (B) and decoction times (C), and the extract yield and the contents of astragaloside and paeoniflorin were evaluated as the comprehensive markers for the purpose.ResultsThe UPLC-ELSD determination of astragaloside had a good linear relationship (r=0.9999), its mean recovery was 103.0%, and it had a good precision, specificity and repeatability.The orthogonal experimental results showed that decoction times (C)>the amount of water (A)> decoction time (B) were major factors affecting the decoction process in order and the ANOVA result showed that decoction times has significant effect on the decoction process(P<0.05).The optimal process of Guiqi Yiqi Yangxue Mixture was adding eight-fold water each time to decoct twice for 1.5 h totally.ConclusionThis optimized water decoction process is feasible and stable, and suitable for industrialized production.

Guiqi Yiqi Yangxue Mixture; orthogonal test; water decoction process; astragaloside; paeoniflorin

安徽省省级中医发展专项——特色中药制剂研发项目(20110629)

祁俊，男，本科，副主任中药师，研究方向：中药制剂及质量标准研究，E-mail：whszyyyzyc@163.com；潘扬，通信作者，男，博士、研究员，研究方向：中药化学与生物技术研究，E-mail：y.pan2006@163.com。

R283.5

A

1005-1678(2015)10-0151-05