牛ATP5B基因启动子双荧光素酶报告基因载体构建与活性检测

段美艳，李安宁，赵志东，王明明，昝林森，2

(1 西北农林科技大学 动物科技学院，陕西 杨凌 712100；2 国家肉牛改良中心，陕西 杨凌 712100)

牛ATP5B基因启动子双荧光素酶报告基因载体构建与活性检测

段美艳1，李安宁1，赵志东1，王明明1，昝林森1，2

(1 西北农林科技大学 动物科技学院，陕西 杨凌 712100；2 国家肉牛改良中心，陕西 杨凌 712100)

【目的】 构建牛ATP5B基因启动子双荧光素酶报告基因重组质粒，并检测其在C2C12细胞系中的表达活性。【方法】 从牛外周血中提取基因组DNA，通过PCR方法从牛基因组DNA中克隆获得牛ATP5B基因的5′端转录调控区的 1 898 bp目的片段，通过设计引物逐段缺失后获得7个亚克隆，将其纯化后经SmaⅠ和KpnⅠ双酶切与pGL3-Basic载体连接，连接产物转化感受态细胞DH5α，得到牛ATP5B基因启动子双荧光素酶报告基因重组质粒，经脂质体基因转染法转染C2C12细胞系后，检测7个重组质粒的荧光素酶活性；运用在线软件Gen-omatix和TFSEARCH对ATP5B启动子区序列进行分析。【结果】 成功克隆获得7个系列缺失的牛ATP5B基因启动子双荧光素酶报告基因重组质粒pATP5B-1898、pATP5B-1607、pATP5B-1293、pATP5B-992、pATP5B-678、pATP5B-462和pATP5B-145；通过转染细胞和荧光素酶活性分析，可知构建的重组质粒均有启动子活性，且重组质粒pATP5B-678和pATP5B-462与空载体pGL3-Basic的荧光素酶活性差异极显著。软件分析结果显示，ATP5B基因启动子区域 -763～-85 bp存在多个重要转录调控元件。【结论】 成功构建了7个系列缺失的牛ATP5B基因启动子双荧光素酶报告基因重组质粒，且证实 -763～-230 bp为牛ATP5B基因的核心启动子区域。

牛；ATP5B基因启动子；双荧光素酶报告基因载体

线粒体ATP合酶是三磷酸腺苷酶(ATPase)的一种，它利用呼吸链产生质子的电化学势能，可通过改变蛋白质的结构来合成ATP，对于细胞的功能及其凋亡有着重要的作用。ATP5B是ATP合酶的β催化亚基，对于整个酶而言，其是催化亚单位，在真核细胞中它催化ATP合成的限速反应，是细胞氧化磷酸化通路上的重要蛋白[1]。此外，ATP5B也是一种代谢蛋白，在生长和发育过程中，其对于调节肌肉细胞和肌原纤维蛋白降解的生化和生理过程起着重要的作用[2-3]，另外许多研究都表明，ATP5B可能对肌内脂肪含量和骨骼肌的氧化代谢等有着重要影响[4-8]。

人类ATP5B基因定位于染色体12q13.13，大约有7.8 kb，含10个外显子，编码 480个氨基酸，mRNA水平分析结果表明ATP5B基因具有组织差异性表达特点，在心脏中高水平表达，在骨骼肌中低水平表达，在肝脏和肾脏中表达量最低[9]。猪的ATP5B基因定位于染色体5p11-p15，该基因mRNA不仅在14个组织中广泛表达，而且在脂肪组织和附睾中显著高表达；而在大白猪和眉山猪2个品种的6个发育阶段中，ATP5B在以上2个品种猪各组织的表达情况相似，但在各个发育阶段眉山猪的ATP5B表达量都显著高于大白猪[10]。在牛上，登录NCBI数据库，查询得到牛ATP5B基因(GenBank 登录号:AC_000162.1)定位于5号染色体，全长 5 374 bp，含10个外显子，应用SECentral软件分析牛ATP5B基因mRNA序列，结果显示其编码528个氨基酸，5′UTR含19个核苷酸，3′UTR含168个核苷酸。以往对牛心脏线粒体ATP合酶结构的研究较多，且证实了ATP5B基因序列在脊椎动物和无脊椎动物中高度保守[11]，近年来从分子水平分析编码ATP合酶基因及其功能的研究也较多。

研究编码线粒体ATP合酶的基因，对于系统了解ATP合酶的结构及作用机制，进而在分子水平上提高肉牛生产性能和牛肉品质具有重要意义。目前，关于牛ATP5B基因的研究报道甚少。本试验利用PCR技术扩增ATP5B基因启动子的DNA序列，并将其插入双荧光素酶报告基因载体pGL3-Basic中，构建了在骨骼肌和肌内脂肪形成中发挥重要作用的牛ATP5B基因启动子双荧光素酶报告基因重组质粒，为进一步研究ATP5B基因的转录水平调控奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材 料

pGL3-Basic质粒及双荧光素酶基因内参质粒pRL-TK，购自Promega公司；大肠杆菌DH 5α由国家肉牛改良中心实验室保存；基因组DNA提取试剂盒购自Tiangen公司；pMD-19T载体，SmaⅠ、KpnⅠ酶，T4 DNA连接酶，均为TaKaRa公司产品；DNA胶快速回收试剂盒、质粒提取试剂盒均购自Promega公司；DMEM/F12培养基及胎牛血清购自Hyclone公司；脂质体转染试剂盒为Invitrogen公司产品；无血清OPTI-MEM培养基购自GIBCO公司。

1.2 牛ATP5B基因启动子及其7个逐段缺失片段的PCR扩增

1.2.1 牛ATP5B基因启动子序列的克隆 按Tiangen公司生产的基因组DNA提取试剂盒说明提取牛外周血基因组DNA ，置于-20 ℃备用。根据GenBank中牛ATP5B基因(GenBank 登录号:AC_000162.1)的启动子区序列，应用引物设计软件Primer 5.0设计合成1对用于扩增ATP5B基因启动子区上游-1 982～-85 bp的引物：上游引物ATP5B-F0序列为5′-CAGTCTTCTCCTTATTCCTCTGCTA-3′ ，下游引物ATP5B-R序列为5′ -TCTGCTTATCACTCTGGGCG-3′，利用计算机辅助分析引物结构，结果发现该对引物满足PCR反应所需条件，引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。

以牛外周血基因组DNA为模板进行PCR反应，反应体系为20 μL，具体组成为：10×Buffer 2.0 μL，KOD 0.4 μL，MgSO40.8 μL，dNTP 2.0 μL，模板DNA 1.0 μL，上游引物 0.6 μL，下游引物0.6 μL，灭菌超纯水12.6 μL。PCR扩增程序为： 95 ℃变性5 min； 94 ℃变性 30 s，57 ℃ 30 s，72 ℃ 130 s，35 个循环；72 ℃延伸10 min。以灭菌超纯水为阴性对照。将PCR产物经8 g/L琼脂糖凝胶电泳检测，回收纯化。对纯化产物加A尾，反应体系(10 μL)为：Mix 5 μL，DNA 5 μL；反应程序为：72 ℃ 20 min。之后将产物与pMD-19T载体在16 ℃恒温仪上过夜连接，连接产物转化感受态细胞DH5α，涂布平板，在氨苄选择培养基上于37 ℃过夜培养，挑选阳性单克隆菌落，37 ℃、200 r/min振荡培养6 h，先进行菌液PCR检测，再从菌液中提取质粒。将质粒送至南京金斯瑞生物科技有限公司测序。

1.2.2 牛ATP5B基因启动子7个逐段缺失片段的克隆与PCR扩增 设计7条可以扩增逐段缺失启动子序列的上游引物(ATP5B-F1～F7)及下游引物ATP5B-R，上游引物都包含KpnⅠ酶切位点,下游引物包含SmaⅠ酶切位点，并分别添加了相对应的保护碱基CGG和TCC(表1)。

表1 供试的PCR引物序列 Table 1 PCR primers used in the experiment

注：“_”和“ ”分别表示酶切位点和保护碱基序列。

Note:Restriction cnzyme cutting sites and protective bases are indicated by “_” and “ ”,respectively.

以1.2.1中菌液为模板，用7对逐段缺失引物进行PCR反应。PCR反应体系为15 μL：Mix 7.5 μL，菌液 1.0 μL，上游引物(10 μmol/L)0.3 μL，下游引物(10 μmol/L)0.3 μL，灭菌超纯水 5.9 μL。PCR扩增程序同1.2.1。以灭菌超纯水为阴性对照。将PCR产物用8 g/L琼脂糖凝胶电泳进行检测，回收纯化。

1.3 重组质粒的构建、鉴定与测序

将纯化后的7个ATP5B基因逐段缺失启动子目的片段和pGL3-Basic 载体用KpnⅠ和SmaⅠ双酶切3 h后，于16 ℃恒温仪上过夜连接，用连接产物转化感受态细胞DH5α，涂布平板，在氨苄选择培养基上于37 ℃过夜培养，挑选阳性单克隆菌落，37 ℃、200 r/min 振荡培养 20 h，将菌液进行PCR检测后提取质粒，分别构建重组质粒pATP5B-1898、pATP5B-1607、pATP5B-1293、pATP5B-992、pAT-P5B-678、pATP5B-462、pATP5B-145，用KpnⅠ和SmaⅠ 进行双酶切鉴定，并测序鉴定重组质粒阳性克隆(测序由南京金斯瑞生物科技有限公司完成)。

1.4 细胞培养与转染

按照LipofectaminTMReagent 2000 脂质体转染系统说明，用含体积分数10%胎牛血清的DMEM培养C2C12细胞系，将生长状态良好的C2C12细胞系按每孔1×105个细胞的密度接种至24孔板，设3个复孔，置于37 ℃、体积分数5%CO2培养箱中培养，待单层细胞长至70%～80%融合时进行质粒转染。每孔分别定量加入 pATP5B-1898、pATP5B-1607、pATP5B-1293、pATP5B-992、pATP5B-678、pATP5B-462、pATP5B-145 载体质粒800 ng，pRL-TK内参载体10 ng，以pGL3-Basic质粒为阴性对照，pGL3-Control质粒为阳性对照，转染24 h后收集细胞。每组试验至少重复2次。

1.5 荧光素酶活性的测定

荧光素酶活性测定基本按照Promega公司生产的双荧光素酶检测试剂盒说明书进行。具体步骤简述如下:弃去24孔细胞培养中的培养液，用PBS轻轻漂洗细胞2次；加100 μL细胞裂解液(1×PLB)，摇床振荡15 min，取20 μL细胞裂解液至检测管中，加入50 μL LAR Ⅱ混匀放入仪器中读数，取出检测管，加50 μL Stop/Glo试剂，混匀后放入仪器中读数，记录 Firefly-Luc/Renilla Luc的比值，并以空载体pGL3-Basic的比值为阴性对照，分析启动子活性。

1.6 生物信息学分析

通过GenBank检索并下载ATP5B基因上游启动区2 kb DNA序列，应用在线软件Gen-omatix(http://www.genomatix.de/cgi-bin//matinspector)、TFSEARCH(http://mbs.cbrc.jp/research/db/TFSEARCH.html)对其启动子区域的序列特征进行分析。

1.7 数据处理

应用SSPS 18.0软件包对各组试验数据之间的显著性进行单因素方差分析(n=3)。

2 结果与分析

2.1 牛ATP5B基因启动子及其逐段缺失片段的PCR扩增结果

以牛外周血基因组DNA为模板，通过上游引物ATP5B-F0和下游引物ATP5B-R进行PCR扩增反应，克隆得到牛ATP5B基因5′侧翼区 1 898 bp片段(图1)；用逐段缺失启动子引物进行PCR扩增，得到了大小与预期结果一致的7个片段(图2)，利用SECentral软件，将测序结果与GenBank所报道的序列进行比对，发现所克隆的序列中位于第一外显子上游第 1 096 个碱基处发生C→T突变(图3)。

图1 牛ATP5B基因启动子的PCR扩增结果 M．DL2000 DNA Marker；1.ATP5B启动子PCR产物；2.阴性对照Fig.1 PCR product of ATP5B promoter M．DL2000 DNA Marker;1.PCR product of ATP5B;2.Negative control

图2 牛ATP5B基因启动子7个逐段缺失片段的PCR结果 M1、M2.DL2000 DNA Marker；1～7.ATP5B启动子7个亚克隆PCR产物；8.阴性对照Fig.2 The 7 sub-clones of ATP5B promoter M1,M2.DL2000 DNA Marker;1-7.PCR products of 7 ATP5B promoter sub-clones;8.Negative control

图3 牛ATP5B启动子克隆片段与NCBI中ATP5B基因序列的比对结果
A.原始序列；B.克隆序列；标△处为发生突变的位点
Fig.3 Comparison of bovineATP5Bpromoter clone fragment sequence analysis with origin sequence in NCBI
A．Original series;B.Cloning sequence;Mutation site is indicated by △

2.2 牛ATP5B基因启动子双荧光素酶报告基因载体的鉴定

PCR产物以及pGL3-Basic载体用KpnⅠ和SmaⅠ双酶切后回收，经T4 DNA连接酶连接后转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，分别构建重组质粒pATP5B-1898、pATP5B-1607、pATP5B-1293、pAT-P5B-992、pATP5B-678、pATP5B-462、pATP5B-145。重组质粒经KpnⅠ和SmaⅠ双酶切后，分别释放出1 898，1 607，1 293，992，678，462和145 bp片段(图4)。测序结果证实了pATP5B-1898、pATP5B-1607、pATP5B-1293均在第一外显子上游第1 096个碱基处发生C→T突变，pATP5B-678、pATP5B-462、pATP5B-145插入序列完全正确，证明ATP5B基因启动子双荧光素酶报告基因质粒构建成功。

图4 牛ATP5B基因启动子双荧光素酶报告基因重组质粒的双酶切鉴定结果M1.1 kb Ladder Marker；M2.DL2000 DNA Marker；m.pGL-Basic的KpnⅠ和SmaⅠ双酶切产物；1～7.7个重组质粒的KPnⅠ和SmaⅠ双酶切产物Fig.4 Identification of the constructed plasmids of bovine ATP5B gene promoter dual luciferase report gene by two restriction enzymes digestionM1.1 kb Ladder Marker;M2.DL2000 DNA Marker;m.Cleavage of of pGL-Basic blank plasmid digested by KpnⅠand SmaⅠ;1-7.7 recombined plasmids digested by restriction enzymes KpnⅠand SmaⅠ

2.3 牛ATP5B基因启动子7个报告基因载体转染细胞后的荧光素酶活性检测

用脂质体基因转染法将重组正确的7个报告基因载体和pGL3-Basic质粒分别转染C2C12细胞系，结果(图5)表明，构建的7个报告基因重组载体质粒转染组的荧光素酶活性均较pGL3-Basic空质粒转染组显著增加(P<0.05)，其中pATP5B-678和pATP5B-462组的荧光素酶活性较pGL3-Basic空质粒转染组极显著增加(P<0.01)，但pATP5B-678与pATP5B-462组之间的荧光素酶活性差异不明显，这表明pATP5B-678与pATP5B-462之间的区域 -763～-230 bp可能包含核心启动子区域。

图5 牛ATP5B基因启动子7个报告基因载体转染细胞后的荧光素酶活性 *和**分别表示与pGL3-Basic空质粒转染组的差异达显著(P<0.05)或极显著水平(P<0.01)Fig.5 Activities of bovine ATP5B gene promoter 7 report gene vectors after being transfected into cells* and ** mean significantly difference at (P<0.05) and (P<0.01),respectively,as compare to pGL3-Basic

2.4 牛ATP5B基因启动子序列的生物信息学分析

应用Gen-omatix和TFSEARCH软件对牛ATP5B基因启动子区域 -763～-85 bp 进行分析，预测结果(图6)显示，该区域除了包含TATA盒、CAAT盒、 GATA-1盒、GATA-2盒外，还有CdxA、v-Myb、deltaE、 C/EBPα和C/EBPβ等一些转录因子结合位点。

3 讨 论

近年来关于ATP5B基因研究较多，且主要集中于对其功能的分析验证方面。ATP5B除了参与能量代谢外，还可以作为多种配体的受体参与脂类代谢调控、控制内皮细胞的增殖与分化以及作为肿瘤的免疫识别标志。有研究表明，ATP5B不仅在线粒体内膜以结构蛋白形式表达，并参与F1-ATPase 催化反应，还分布于细胞膜的表面[12]。在C2C12肌管细胞发育过程中，细胞膜上不规则定位的ATP5B与钙离子通道α2/δ1亚基互作，从而形成了一个可以调控钙离子释放的功能信号复合物，此调控过程已通过重复性地电刺激肌管试验被证实[7]。血管内皮细胞(ECs)的ATP5B能与抑制素结合，表明膜结合的ATP5B参与了血管的形成[13]。总之，这些研究表明ATP5B除了参与氧化磷酸化反应之外，在骨骼肌和血管形成上也发挥着重要作用。另外，在肝脏分解代谢过程中，高密度脂蛋白(HDL)通过干扰作用于内皮细胞的促凋亡因子而起保护作用，HDL携带的脂蛋白和酶具有抗氧化的功能[14]。肝细胞的表层ATP5B作为富含载脂蛋白AI或载脂蛋白E的高密度脂蛋白的受体，在HDL的代谢机理和ATP的生物合成中起重要作用。此外，Zheng等[15]研究发现，单纯疱疹病毒-1(herpes simplex virus-1，HSV-1)感染时，宿主细胞编码的miR-101表达增强，会抑制ATP5B活性以减少细胞内ATP的产生，从而影响病毒复制，起到抗病毒作用。

图6 牛ATP5B启动子转录因子结合位点的预测结果
Fig.6 Predicted binding sites for transcription factors in bovineATP5Bgene 5′ flanking region

本研究通过逐段缺失牛ATP5B基因启动子区，成功构建了7个5′端不等、3′端平齐的启动子双荧光素酶报告基因重组质粒，并通过转染C2C12细胞系对这些重组质粒的活性进行了分析，定位了与转录相关的关键转录调控元件所在位置为pATP5B-678与pATP5B-462的约500 bp (-763～-230 bp)区域，且该区域是牛ATP5B基因的核心启动子区域。

运用在线软件Gen-omatix(http://www.genomatix.de/cgi-bin//matinspector)、TFSEARCH(http://mbs.cbrc.jp/research/db/TFSEARCH.html)对该区域核心启动子序列特性进行分析，并对比Xu等[10]对猪ATP5B基因启动子的转录因子结合位点软件预测结果，可知该区域包含有GATA盒及v-Myb、deltaE转录调控元件，而Xu等[10]的研究结果显示，猪的APT5B启动子区没有TATA盒、CAAT盒这2个重要转录调控元件。GATA盒是具有调控靶基因表达水平作用的转录因子家族，有保守的锌指结构。Tong 等[16]报道， GATA盒在脂肪的形成中起重要作用，尤其是GATA-2、GATA-3。v-Myb是一个转录活化因子。Karafiat等[17]研究发现，转录调控元件v-Myb 和c-Myb 参与血液祖细胞及其前体细胞的分化，且对于NC(神经脊) 细胞有相似的作用,都是通过激活SCF/c-kit 信号通路来作用于黑色素细胞系的分化[18]。C/EBPα和C/EBPβ则对于诱导细胞分化及调控脂肪形成有重要作用。本研究中，以上转录调控元件在ATP5B基因转录调控机制中的具体作用还不明确，但确定了牛ATP5B基因的核心启动子区域，可以为ATP5B基因的转录调控机制研究奠定基础，本试验下一步的研究重点是探明重要的顺式作用元件及其在转录调控过程中所起的作用。

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Construction and identification of bovineATP5Bgene promoter dual luciferase report gene vector

DUAN Mei-yan1,LI An-ning1,ZHAO Zhi-dong1,WANG Ming-ming1,ZAN Lin-sen1,2

(1CollegeofAnimalScienceandTechnology,NorthwestA&FUniversity,Yangling,Shaanxi712100,China;2NationalBeefCattleImprovementCenterinChina,Yangling,Shaanxi712100,China)

【Objective】 The research was conducted to construct the dual luciferase reporter gene plasmid ofATP5Bgene promoter from bovine and detect the expression activities by transfecting into the C2C12 cells.【Method】 Bovine genome DNA was extracted from blood cells,and from which a 1 898 bp fragment of the 5′ flanking region ofATP5Bgene was isolated by PCR.Then 7 sub-clones were obtained by the design of primers.The PCR products were purified and double digested bySmaⅠ andKpnⅠ before being inserted into pGL3-Basic vectors by homologous recombination and the vectors were transferred into DH5α cells.At last,dual luciferase report gene vectors of bovineATP5Bgene promoter were constructed and transfected into the C2C12 cells by LPS before the activities of 7 recombined plasmids were measured and the sequence ofATP5Bgene 5′ end was analyzed by online software.【Result】 A total of 7 recombined plasmids (pATP5B-1898,pATP5B-1607,pATP5B-1293,pATP5B-992,pATP5B-678,pATP5B-462,and pATP5B-145) of bovineATP5Bgene promoter dual luciferase report gene vectors were successfully cloned.Luciferase activity assay indicated that all the recombined plasmids had significant activity.pATP5B-678 and pATP5B-462 had extremely significant difference compared to pGL3-Basic.Sequence analysis by Gen-omatix and TFSEARCH indicated that there were many putative binding sites for transcription factors in the region of -763--85 bp ofATP5Bgene promoter.【Conclusion】 A total of 7 dual luciferase report gene recombined plasmids of bovineATP5Bgene promoter were successfully constructed,activity analysis in C2C12 cells indicated that the regionsof -763--230 bp contained key transcription regulatory elements.

bovine;ATP5Bpromoter;dual-luciferase reporter

2014-01-17

国家自然科学基金项目(31272411)；国家“863”计划项目(2013AA102505，2011AA100307-02)；国家科技支撑计划项目(2011BAD28B04-03)；国家转基因育种专项(2011ZX08007-002)；国家肉牛牦牛产业技术体系项目(CARS-38)；陕西省科技统筹创新工程计划项目(2014KTZB02-02)

段美艳(1990-)，女，山西五台人，硕士，主要从事肉牛基因转录调控研究。E-mail：dmy.sunny.2008@163.com

昝林森(1963-)，男，陕西扶风人，教授，博士生导师，主要从事肉牛奶牛遗传改良与健康养殖研究。 E-mail：zanlinsen@163.com

时间:2015-06-30 13:47

10.13207/j.cnki.jnwafu.2015.08.026

Q78；S823.8

A

1671-9387(2015)08-0039-07

网络出版地址:http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1390.S.20150630.1347.026.html