老年非小细胞肺癌患者血浆EGFR突变与 EGFR⁃TKI疗效研究

谢丽 禹立霞 刘宝瑞 尹震宇

2004年，Lynch等［1］首次报道了表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor，EGFR）突变与酪氨酸激酶抑制剂（tyrosine kinase inhibitor，TKI）疗效相关的药理机制。自此，EGFR酪氨酸激酶（tyrosine kinase，TK）区活化突变与晚期非小细胞肺癌（NSCLC）小分子TKI疗效的关系成为临床研究的热点。经IPASS、EUR⁃TAC等多项临床研究证实，以EGFR19外显子缺失突变和21外显子L858R点突变为主的活化突变是NSCLC TKI治疗获益的重要预测因子［2⁃3］。因而，治疗前 EGFR突变情况是决定是否行EGFR⁃TKI治疗的重要因素。

EGFR突变传统而经典的检测方法是取得肿瘤组织后行Sanger测序法。近年来，由于检测技术的快速发展，如 SARMS⁃PCR，digital PCR，二代测序等，外周血游离DNA突变检测成为现实。部分肺癌患者由于其肿瘤部位特殊难以取得病理或者年老体弱患者难以承受手术及穿刺活检，使得外周血进行EGFR突变检测在临床具有较强实用性［4］。本研究在前期建立灵敏的外周血循环DNA EGFR突变检测技术下［5］，收集了65例老年NSCLC病例进行EGFR突变检测，并探讨了血循环游离EGFR突变状态与患者EGFR⁃TKI治疗效果的关系。

1 对象与方法

1.1 研究对象 2011年7月至2012年5月南京大学医学院附属鼓楼医院肿瘤中心治疗的65例老年（＞60岁）NSCLC患者，所有病例均为不能耐受化疗或化疗后肿瘤复发转移患者。其中男46例，女19例，平均年龄（72.3±7.2）岁，其中腺癌30例，鳞癌27例，未知类型8例。

1.2 检测方法

1.2.1 标本采集和DNA提取：患者清晨空腹抽取抗凝静脉血 2 ml，于4℃放置 2 h后低温离心，3000 r／min，离心10 min；移取上清至新的离心管中，再次高速离心13 000 r／min，离心10 min；留取血浆至新的离心管中，于－80℃保存。血浆标本完全解冻后，采用 QIAamp DNA Blood mini kit（Qiagen）按说明书提取DNA，最后将DNA溶解于40 μl的DNA洗脱液中，置－20℃低温冰箱保存。

1.2.2 EGFR基因外显子19缺失突变检测方法：引物 序 列： 19F1： 5'⁃GAAGGTGAGAAAGAT⁃AAAATTC⁃3'； 19R1： 5'⁃CTGAGGTTCAGAGCCATGGA⁃3'； 19F2：5'⁃GATAAAATTCCCGTC⁃GCTATC⁃3'； 19R2： FAM⁃CA⁃CACAGCAAAGCAGAAC。PCR反应体系均为10×PCR buffer 2 μl，dNTP 0.5 μl，上下游引物为 1 μl，Taq 酶0.1 μl，DNA 2 μl，用水补足 20 μl。热循环参数：95 ℃预变性30 s；95 ℃变性15 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，30 个循环。酶切反应为：Buffer R 2 μl，Tru1 I 1 μl，水 18 μl，PCR 产物 10 μl，65 ℃孵育 2 h，直接取酶切反应产物进行PCR，条件同前，引物为F2、R2。将第2次PCR产物稀释100倍，加入适量500⁃LIZ，热变性，在ABI 3130基因分析仪进行片段分析。

1.2.3 EGFR基因外显子21 L858R点突变采用PNA⁃PCR联合 taqman探针法检测：引物 21F 5'⁃ACACCGCAGCATGTCAAGA⁃3'， 21R 5'⁃TTCTCTTCCG⁃CACCCAG⁃3'，探针 21Wt VIC⁃CACAGATTTTGGGCTG⁃GCCAAAC⁃TAMRA， 21MtFAM⁃GATTTTGGGCGGGC⁃CAAAC⁃TAMRA，PNA GTTTGGCCAGCCCA。

1.3 治疗和评价 对其中不能耐受化疗或化疗后肿瘤进展、复发的患者接受吉非替尼单药250 mg／d或厄洛替尼150 mg／d口服治疗。在口服EGFR⁃TKI 2月后复查胸部CT，按RECIST（response evaluation criteria in solid tumor）1.0 标准评价疗效［6］。

1.4 统计学处理 所有统计学分析均采用SPSS 11.5统计软件，计数资料采用率进行描述，卡方检验进行比较分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 EGFR基因突变检测结果与临床特征的关系本研究中65例老年NSCLC癌患者，外周血EGFR突变检测阳性为19例（29.23%），其中男性7例，女性12例。进一步分析 EGFR基因突变与临床各项参数之间的关系发现，血浆EGFR基因突变主要见于肺腺癌、女性患者和非吸烟患者（表1）。

表1 血浆EGFR突变与临床基线特征关系（n）

2.2 外周血EGFR突变患者与EGFR⁃TKI疗效关系 19例老年NSCLC患者外周血测得EGFR突变有7例为首次诊断，因高龄、身体状况较差，选择分子靶向药物吉非替尼或厄洛替尼治疗。12例为既往化疗后疾病进展患者，后续难以承受进一步穿刺活检及化疗患者。其中3例为既往口服EGFR⁃TKI后有进展患者，这3例患者后续未行EGFR⁃TKI治疗。16例口服EGFR⁃TKI患者治疗有效率高达87.5%（部分缓解10例，稳定4例）。

3 讨论

TK与肿瘤发生发展和转移过程中参与细胞信号转导的蛋白质的关系密切，催化许多重要蛋白质的TK残基的磷酸化，可影响细胞的增殖和分化。TKI是特异性作用于TK，阻断其下游通路的一类小分子化合物。进展期 NSCLC常规化疗有效率≤40%，而在EGFR活化突变患者约71%～90%的患者均能从EGFR⁃TKI（吉非替尼／厄洛替尼）治疗中获得疗效，且无进展生存时间（PFS）能够长达7.7～13.3月，并能够获得长达3年的总生存期（OS），在EGFR⁃TKI使用之前 OS 仅为半年左右［7⁃8］。

老年患者因多伴随肺气肿、慢性支气管疾病及心脑血管等基础疾病，体力状况较差，因此，手术及有创伤风险的穿刺活检往往并不适合，为肿瘤诊断及分子生物学检测带来一定困难。另一方面，年老体弱患者往往也并不适合进行化疗［9］。分子靶向药物由于不良反应相对较小，因而近年来，NCCN指南已明确老年NSCLC EGFR突变患者可一线选择 EGFR⁃TKI治疗［10］。安全可靠的检测EGFR突变的方法将为老年NSCLC患者 EGFR⁃TKI的使用提供指导。外周血DNA突变检测的优点恰恰在于几乎无创，因而能够即时检测，从而避免有创的操作。

本研究中采用了酶切富集联合片段分析法检测了EGFR19外显子缺失突变，采用PNA⁃PCR联合Taqman探针法检测了L858R点突变，既往研究表明该检测方法灵敏度可达到1∶1000［5］。既往的研究有多个技术用于血浆游离 DNA 检测：例如 SARMS⁃PCR、Cast⁃PCR、BEAMING及最近的digital PCR等方法，其灵敏度均可达1∶1000以上［4］。然而，从成本计算，本研究采用的方法价格相对低廉，尤其是19外显子，采用片段分析方法检测基因缺失，可以同时检测多种缺失突变。Li等［12］对13篇NSCLC游离DNA检测EGFR突变文章共1591个病例进行分析，结果显示与肿瘤组织EGFR突变状态相比较，外周血游离EGFR突变检测敏感性为64.5%（95%CI：0.605～0.683），特异性为88.5%（95%CI：0.863～0.904）。由此可见，外周血EGFR突变检测具有较高的特异性，提示其阳性结果具有重要的临床意义，而由于多方面的因素，其敏感性较差，原因在于：（1）外周血游离DNA量不恒定。既往研究表明肿瘤负荷越大、增殖越活跃，往往患者外周血游离DNA含量较高，但并无明确关系，而外周血DNA含量对于EGFR突变的检出具有较大影响；（2）肿瘤异质性，同一肿瘤不同恶性肿瘤细胞群的分子生物学背景往往不太一致，因此，若进入外周血的突变EGFR比例有限则导致EGFR突变检出率的下降。

本研究NSCLC患者血浆EGFR突变率为29.23%，主要集中于肺腺癌、女性患者和非吸烟患者，5例Ⅰ～Ⅱ期非小细胞肺癌患者均未测得EGFR突变，考虑与肿瘤负荷不大，外周血肿瘤来源的DNA含量相对较低有关，以上结果与既往文献类似［11］。16例患者采用EGFR⁃TKI口服治疗，治疗2月后仅2例患者病情进展，10例患者部分缓解，4例患者为病情稳定，可见，血浆游离DNA EGFR突变检测结果有效指导了EGFR⁃TKI的使用。对于老年患者而言，能够避免接受有创的检查及具有较大不良反应的化疗，对临床具有一定指导作用。

［1］Lynch TJ， Bell DW， Sordella R， et al.Activating mutations in the epidermal growth factor receptor underlying respon⁃siveness of non⁃small⁃cell lung cancer to gifitinib［J］.N Engl J Med， 2004，350（21）：2129⁃2139.

［2］Mok TS， Wu YL， Thongprasert S， et al.Gefitinib or carbo⁃platin⁃paclitaxel in pulmonary adenocarcinoma［J］.N Engl J Med， 2009， 361（10）：947⁃957.

［3］Rosell R， Carcereny E， Gervais R， et al.Erlotinib versus standard chemotherapy as first⁃line treatment for European pa⁃tients with advanced EGFR mutation⁃positive non⁃small⁃cell lung cancer（EURTAC）： a multicentre， open⁃label， random⁃ised phase 3 trial［J］.Lancet Oncol， 2012， 13（3）：239⁃246.

［4］Rosell R， Molina MA， Serrano MJ.EGFR mutations in cir⁃culating tumour DNA［J］.Lancet Oncol， 2012， 13（10）：971⁃973.

［5］谢丽，尹震宇，魏嘉，等.血浆EGFR19外显子缺失突变高灵敏度检测技术的建立［J］.临床肿瘤学杂志，2014，19（5）：407⁃410.

［6］Therasse P， Arbuck SG， Eisenhauer EA， et al.New guide⁃lines to evaluate the response to treatment in solid tumors.European Organization forResearch and Treatmentof Cancer， National Cancer Institute of the United States， Na⁃tional Cancer Institute of Canada［J］.J Natl Cancer Inst，2000， 92（3）：205⁃216.

［7］Ohashi K， Maruvka YE， Michor F， et al.Epidermal growth factor receptor tyrosine kinase inhibitor⁃resistant disease［J］.J Clin Oncol， 2013， 8（31）：1070⁃1080.

［8］许有涛，尹荣，李明，等.吉非替尼新辅助治疗ⅢA⁃N2期表皮生长因子敏感突变肺癌的临床观察［J］.实用老年医学， 2014，28（6）：469⁃472.

［9］俞龙，谢利军，金琳羚，等.94例老年非小细胞肺癌临床分析［J］.实用老年医学，2013，27（4）：292⁃294.

［10］Ettinger DS， Akerley W， Borghaei H， et al.Non⁃small cell lung cancer， version 2.2013［J］.J Natl Compr Canc Netw，2013， 11（6）：645⁃653.

［11］Jiang B，Liu F，Yang L，et al.Serum detection of epidermal growth factor receptor gene mutations using mutant⁃enriched sequencing in Chinese patients with advanced non⁃small cell lung cancer［J］.J Int Med Res， 2011， 4（39）：1392⁃1401.

［12］ Li Z，Zhang Y，Bao W，et al.Insufficiency of peripheral blood as a substitute tissue for detecting EGFR mutations in lung cancer：a meta⁃analysis［J］.Target Oncol， 2014， 9（4）：381⁃388.