应用生物模拟采样法快速评估水中邻苯二甲酸酯的生物富集性

周东星，许宜平，王子健

1. 中国科学院生态环境研究中心 中国科学院饮用水科学与技术重点实验室，北京100085 2. 中国科学院生态环境研究中心 环境水质学国家重点实验室，北京100085

应用生物模拟采样法快速评估水中邻苯二甲酸酯的生物富集性

周东星1,2，许宜平1,*，王子健2

1. 中国科学院生态环境研究中心 中国科学院饮用水科学与技术重点实验室，北京100085 2. 中国科学院生态环境研究中心 环境水质学国家重点实验室，北京100085

利用三油酸甘油酯-醋酸纤维素半透复合膜(TECAM)对12种邻苯二甲酸酯类化合物(PAEs)进行微耗式快速富集试验(24 h)，估算生物模拟采样方法对PAEs化合物的富集动力学参数以及富集系数，比较了膜富集系数(MCF)与生物富集系数(实验测定、模型预测)之间的相关性，及其随化合物的辛醇-水分配系数(KOW)的变化趋势。结果表明：(1)随着疏水性的增强，化合物在TECAM膜中具有不同的富集趋势：弱疏水性化合物能快速平衡，中疏水性化合物先经历线性富集阶段随后到达曲线富集阶段，中强疏水性化合物一直处于线性阶段；(2)膜对PAEs的富集系数随KOW的增加先上升后下降，与BCF随KOW的变化趋势一致，同时两种富集系数对KOW均符合二次曲线模型，并且MCF的相关性更好；(3)对MCF整体高于BCF的结果做出了解释——生物代谢使得BCF偏低，而TECAM对PAEs的富集不涉及代谢过程。尽管MCF不能表征生物体对邻苯二甲酸酯等可生物降解目标化合物的代谢过程，但该方法不受物种个体差异影响，具有估算水生生物富集目标化合物的潜在能力，更利于化合物之间的评估比较，并可作为对比研究生物代谢对BCF的影响。

邻苯二甲酸酯；生物富集；生物代谢；生物模拟采样；三油酸酯半透复合膜

化学物质管理已将PBT物质(持久性、生物富集性和毒性)作为重点关注对象，其中评价化合物的生物富集性对研究化合物潜在的风险具有重要意义，同时也能够为环境质量基准的制订提供依据。但是生物富集性的评价往往受到各种因素(环境因素、生物因素)的影响，增加其不确定性[1]。近年来，生物模拟采样技术开展化合物生物富集性评价已迅速发展并广泛运用，这种被动式采样技术能够有效监测水环境中目标化合物[2-3]。因此，本文利用一种新型生物模拟技术对目标化合物邻苯二甲酸酯类(phthalate esters，简称PAEs，别名酞酸酯)进行研究，以期能够评价此类容易受到生物因素(生物代谢)影响的化合物的生物富集性。

邻苯二甲酸酯类作为增塑剂广泛使用并不断进入环境，成为人们日益关注的污染物[4]。有关研究[5]表明，PAEs的生物代谢和生物转化能够显著影响其在鱼体内的生物富集。现有的预测化合物生物富集系数的模型多以辛醇-水分配系数(KOW)为基础，虽然能够较好的预测生物富集系数(BCF)，但对于一些容易生物代谢和生物转化的化合物而言，还需考虑生物代谢的相关参数(例如代谢速率常数kM)，利用此类参数预测生物富集系数还需要寻求新的评价模型和方法。新型被动式采样器三油酸甘油酯-醋酸纤维素复合膜(TECAM)中的三油酸甘油酯以嵌入的方式与醋酸纤维素紧密结合，三油酸甘油酯是鱼类脂肪的典型组成成分[6]，Ke等[7]的研究表明TECAM可以作为替代生物富集的新型采样器，同时TECAM对化合物只有吸收和消除两个阶段，而没有鱼类对化合物的代谢和转化阶段，因此通过对比鱼类和TECAM对化合物的富集，可以研究代谢速率常数对富集效果的影响。本文针对12种PAEs(见表1)进行TECAM富集试验，其logKOW分布在1.11～8.60之间，研究PAEs在TECAM中富集，并与前人研究的鱼类对PAEs的富集进行对比，以期利用膜富集系数、代谢速率常数对生物富集系数进行初步预测。

1 材料与方法(Materials and methods)

1.1 仪器与试剂 气相色谱/质谱联用仪(GC/MSD)为Agilent HP6890/5975MSD系列(美国Agilent)；C18固相萃取柱(6 mL每500 mg，美国Supelco)；固相萃取装置VisiprepTMDL十二管防交叉污染固相萃取装置(美国Supelco)； KL512型氮吹仪(北京康林科技公司)；超声波清洗仪(KQ-250D型数控超声波清洗器)。 无水硫酸钠(优级纯，北京化学品公司)，400 ℃焙烧2 h备用；正己烷、二氯甲烷(农残级，Fisher公司)；甲醇(色谱纯，Fisher公司)；叔丁基甲基醚(色谱纯，J&K Scientific 公司)。PAEs混合标样(1 000 μg·mL-1溶解于正己烷中)购自美国AccuStandard公司。

1.2 三油酸甘油酯-醋酸纤维素复合膜(TECAM)材料

TECAM膜材料的制备方法[8]：利用Loeb-Sourirajan方法(沉浸凝胶法)制备，组成成分为——醋酸纤维素：丙酮：二氧六环：无水高氯酸镁：三油酸甘油酯=9:35:5:1:0.75(质量比，单位g)。TECAM 外层为亲水的醋酸纤维素，内部为疏水的三油酸甘油酯。将膜裁成4 cm × 6 cm大小，洗净后于去离子水中保存备用。

1.3 微耗式富集动力学试验

微耗式采样(negligible depletion sampling)[9]是研究生物可利用性或生物富集的推荐实验手段，要求提取的疏水性有机物的量不超过体系中该化合物总量的10%，此时可认为测量介质不会对目标化合物在水中的自由溶解态和有机质结合态之间的平衡状态造成影响。因此，富集试验采用每小时更换一次溶液保证微耗式采样的实现。富集实验PAEs溶液浓度为500 ng·L-1，将一张TECAM膜片(4 cm × 6 cm)放入配有1 L实验溶液的具塞锥形瓶中，置于25℃恒温、100 r·min-1的摇床上，采样时间点设置为：1、2、3、6、9、12、15、24 h，每次采集3个平行样。

1.4 样品预处理

将TECAM膜样从溶液中取出，用去离子水冲洗表面，然后用洁净滤纸擦干膜表面的水分，迅速称重记录，浸入正己烷/二氯甲烷(体积比，50:50)的混合溶剂超声提取10 min，重复3次，每次均更换新溶剂，合并3次提取液，氮吹浓缩并置换溶剂为正己烷，准确定容至0.5mL，准备上机分析测定。

水样样品经C18固相萃取柱(6 mL每500 mg，Supleco公司，美国)富集，C18柱在使用前依次用叔丁基甲基醚、甲醇、超纯水各5 mL活化平衡，每次加液后均保持5 min，然后再打开真空泵抽取液体。活化之后加载水样，调节好真空度，水样流速保持在5 mL·min-1左右。富集完毕后，用10 mL甲醇/叔丁基甲基醚=1:9(V/V)为淋洗剂分3次(4 mL、3 mL、3 mL)进行洗脱。氮吹浓缩并置换溶剂为正己烷，准确定容至0.5 mL，准备上机分析测定。

1.5 GC/MS条件及定量分析

采用Agilent6890/5975气相色谱质谱仪进行PAEs分析，检测器为70 eV离子源的质量选择检测器(MSD)，配备Agilent7683型液体自动进样器(Agilent Technologies，美国)。实验使用的熔融石英毛细管色谱柱为购自美国J&W Scientific公司的DB-5 MS毛细色谱柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)。质谱离子源：电子轰击源(EI)，电子能量70 eV，离子源温度300 ℃；四级杆质量分析器温度150 ℃；质谱检测器温度280 ℃。色谱条件：纯度99.999%的氦气作载气，无分流进样，恒流2.0 mL·min-1；进样口温度250 ℃；进样量1 μL；溶剂延迟6 min；SIM模式下升温程序：80 ℃保持2 min，以10 ℃·min-1升到190 ℃，然后以15 ℃·min-1升到280 ℃，保持3 min。将12种PAEs混合标准样品通过检索NIST质谱谱库和色谱峰保留时间进行定性分析，并采用外标峰面积法、六点标准曲线定量计算。

1.6 质量控制与空白实验

空白实验：设置TECAM的膜样空白、去离子水样空白各3组。水样空白中，12种目标化合物均有少量检出，除DBP浓度较高((188.5±47.5)ng·L-1)外，其他11种化合物浓度在14～44 ng·L-1之间，3组空白变异系数均在15%以下。膜样空白中，除DBP外未检出其他目标化合物。最终分析结果均扣除空白。

加标实验：每批水样和膜样处理时均设一组质量控制样品加标实验。水样固相萃取加标回收率在62.2%～124.3%(仅DEEP超过120%，其他化合物在62.2%～92.7%之间)。TECAM被动采样回收率在70.5%～115.2%。最终分析结果均经过回收率校正。

12种化合物水样实测浓度与名义浓度之间相对误差在1.8%～19.2%之间，符合生物富集试验标准方法中相对误差在20%之内的要求。

2 结果(Results)

2.1 TECAM生物模拟采样对PAEs的富集动力学

在TECAM采样时，若其富集水中有机污染物的量相对于该污染物的总量来说非常小时，该过程为一级动力学反应，可用两相分配模型表示[10-11]：

(1)

式中CTECAM为富集t时间后有机污染物在TECAM中的浓度(ng·g-1)，CW是该污染物在水中的浓度(ng·L-1)，ku为富集介质吸收速率常数(L·(g·d)-1)，ke为释放该污染物的速率常数(d-1)，t为富集时间(d)。

当公式(1)中ket值很小时(即ket<<1)，则污染物在TECAM中的富集处在连续线性采样阶段，公式(1)可以简化为一次线性模型[12]：

CTECAM=CWkut

(2)

表1 12种邻苯二甲酸酯a

注：a数据源于EPI SuiteTM(U.S. Environmental Protection Agency)。

Note: From EPI SuiteTM(U.S. Environmental Protection Agency).

而当ket>>1，公式(1)又可以简化成一个平衡分配模型：

(3)

式中MCF为污染物的TECAM-水平衡分配系数，即TECAM膜富集系数。

12种PAEs经TECAM微耗式富集可以得出3种结果：

(1) 富集平衡阶段的化合物

图1中有3种化合物(DMEP、DEEP、DEP)在短时间内达到并保持平衡状态，此时TECAM膜富集系数MCF可用公式(3)计算。

(2) 曲线富集阶段的化合物

图2中有2种化合物(DBEP、DBP)已经过了线性阶段并达到曲线富集阶段，则在TECAM中的富集可用公式(1)拟合，拟合得出各项富集参数。

(3) 线性富集阶段的化合物

图3中有7种化合物(DPP、BBP、DHXP、DCHP、BMPP、DNOP、DNP)处于线性富集阶段，则在TECAM中的富集可简单地用一次线性模型公式(2)拟合表示。

鬼子队长对灯草老爹的解释深信不疑，竖起大拇指说：“你的老头，专家的有！”回转身，一把揪住刁德恒的衣领，“刁，你的八格牙路，死啦死啦的！”

上述三种模型拟合结果得到生物模拟采样(TECAM)富集邻苯二甲酸酯的传质速率常数(吸收速率常数和消除速率常数)列于表2中。

2.2 两种富集系数(MCF、BCF)和辛醇-水分配系数之间的相关性

将12种PAEs的膜富集系数(MCF)以及文献中实验测得的BCF、EPI Suite预测得到的BCF值进行比较(表3)：

EPI Suite预测得到的logBCF和logMCF对logKow的关系均符合二次曲线模型[14]:logBCF=-0.093log2Kow+1.273logKow+0.084R2=0.51

(4)

logMCF=-0.083log2Kow+1.114logKow+1.878R2=0.67

(5)

图2可以得知MCF随化合物KOW变化趋势与模型预测BCF有一致性的规律，两种富集系数均随logKOW的增加先升高，在6.5附近达到最高，然后下降，此结果与文献报道一致[15]。

图1 生物模拟采样(TECAM)对邻苯二甲酸酯的富集动力学曲线注：A)快速达到富集平衡状态的PAEs； B)经过线性富集并到达曲线阶段的PAEs；C)处于线性富集阶段的PAEs。Fig. 1 Uptake kinetic curves of 12 PAEs in TECAMsNote: A) PAEs in equilibration stage; B) PAEs in linear and nonlinear stage; C) PAEs in linear stage only.

表2 生物模拟采样(TECAM)富集邻苯二甲酸酯的传质速率常数

中等疏水性(中等分子量)PAEs，logMCF与logKOW非常接近(二项式系数a接近于0，b接近1)，logBCF比logKOW略低，这说明生物代谢作用对BCF有一定影响；强疏水性(高分子量)PAEs(DNOP、DNP)，logMCF、logBCF均显著低于logKOW，BCF受生物代谢作用影响显著，而MCF应该是受到较高的消除速率常数影响(具体机制有待进一步研究)。

图2 PAEs的脂类归一化富集系数注：包括实验测定鱼类BCFO、模型预测BCFP及被动采样MCF与其KOW的关系图(图中鱼类BCF数据来自文献[13]，模型预测BCF数据来自EPISuite TM软件)Fig. 2 Relationships between lipid-normalized BCFs,MCFs and KOWS of PAEsNote: observed fish BCF data was from Staples et al. [13],predicted BCF data was from EPI Suite TM

文献中几种鱼类实验测得的BCF见表3和图2。若考虑排泄作用、代谢作用、生长稀释，鱼体内生物富集系数可由公式(6)表示[18]：

(6)

其中，k1为吸收速率常数、k2为消除速率常数、kE为排泄速率常数、kM为代谢速率常数、kG为生长(稀释)速率常数。

结合图4和公式(6)，文献报道鱼类实际观测BCF与化合物KOW之间没有明显相关规律，同一种PAEs的BCF数值十分分散，存在显著的种间差异。这种差异可能与不同鱼类对PAEs的代谢能力差异有关。实验数据表明，鱼类的排泄速率常数、生长(稀释)速率常数相比消除速率常数、代谢速率常数要小得多(相差一个数量级以上)，在此可以忽略不计；而不同种实验鱼类对同一种PAEs的吸收速率常数和消除速率常数则非常近似[13]，因此kM可能是影响可降解PAEs类化合物生物富集的主要参数。文献报道数据[13]也证明，处于不同营养级的实验鱼类对PAEs(尤其是高分子量PAEs)的代谢速率的差异非常大，大型摄食鱼类(S. acanthias)代谢速率明显高于小型饵料鱼类(L. armatus)，其结果导致同种化合物在前者体内的BCF显著低于后者。

相比于易受到生物内在过程影响的实验测定BCFO，生物模拟采样获得的MCF，则仅受到目标化学物质的固有理化性质(不需要考虑有机体内过程等生物因素)的影响，可以理解为化学物质生物富集系数的理论值，表征生物体吸收富集该物质的潜在能力，这一参数显然与物种个体及其所处营养级无关。

3 讨论(Discussion)

(1)处于线性富集阶段的化合物，logKOW均为4以上(DPP的为3.40)，说明TECAM对此类强疏水性化合物的富集平衡还需一定时间；而已经进入曲线阶段的化合物，logKOW为4.06和4.27，说明TECAM对此类中等疏水性的化合物吸收，相比于强疏水性化合物来说平衡时间较短；迅速进入平衡的化合物，logKOW均小于3(分别为1.11、2.10、2.54)，说明TECAM对此类疏水性较弱的化合物能快速到达平衡；

(2)同logKOW水平下，PAEs的logMCF数值较logBCF大，原因可能是由于TECAM对化合物的吸收没有代谢的后续过程，而BCF生物代谢影响，说明PAEs的生物代谢的性质是造成两条曲线数值差异的原因，logMCF数值较logBCF大，原因可能是TECAM对化合物吸收后没有代谢的后续过程，而BCF是经过生物代谢之后测得，生物代谢作用能够很强的限制化合物在生物体内的富集。

表3 邻苯二甲酸酯的生物富集系数(鱼类实测值、模型预测值)以及TECAM生物模拟采样富集系数

注: a数据来源于文献[13]; b数据来源于EPI SuiteTM软件(U.S. EPA，4.1)的模型预测结果，并按照鱼类平均脂肪含量5%进行脂肪归一化; c膜富集系数按照TECAM半透膜的三油酸酯含量(7.7%)进行脂肪归一化。

Note: a Observed data was from Staples et al.[13]; b Predicted data was from EPI SuiteTM(U.S. EPA, version 4.1); c MCF data was normalized by lipid content of 7.7% in TECAMs.

(3)尽管MCF不能表征生物体对PAEs等可生物降解目标化合物的代谢过程，但该方法不受物种个体差异影响，具有单一估算水生生物富集目标化合物的潜在能力，更利于化合物之间的评估比较；与模型预测BCF方法相比，通过具体实验快速测定的MCF，可同时考虑生物有效性和其他环境因子影响，更接近实际环境，减少方法不确定性。

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Rapid Evaluation of Bioconcentration Potential for Esters Using a Biomimetic Sampler

Zhou Dongxing1,2, Xu Yiping1,*, Wang Zijian2

1. Key Laboratory of Drinking Water Science and Technology, Research Center for Eco-Environmental Sciences, Chinese Academy of Sciences, Beijing10085, China 2. State Key Laboratory of Environmental Aquatic Chemistry, Research Center for Eco-Environmental Sciences, Chinese Academy of Sciences, Beijing10085, China

14 April 2014 accepted 23 May 2014

A negligible depletion sampling test of 12 phthalates esters (PAEs) was carried out using the biomimetic sampler, triolein embedded cellulose acetate membrane (TECAM), for 24 hours. The uptake kinetic parameters and membrane concentration factors (MCFs) of TECAMs were evaluated, as well as the correlation features among MCFs, bioconcentration factors (BCFs) and octanol-water coefficients (KOWs) of PAEs. The results showed that trends of uptake of the PAEs varied with the increase of hydrophobicity. Similar quadratic correlations could be observed between MCF-KOWand BCF-KOWof selected PAEs, whereas the regression of MCF KOWshowed better results. The reduction of BCFs com pared to MCFs for the selected PAEs is thought to be due primarily to metabolism in the biotic media. Therefore, the biomimetic sampling method with TECAMs can be considered not only as a useful tool for rapid evaluation of bioconcentration potential, but also as a reference method for interpreting metabolic effects of nonpersistent organic chemicals such as PAEs.

PAEs; bioconcentration; metabolism; biomimetic sampling; TECAM

国家“863计划”重大项目(2012AA06A302)

周东星(1988-)，男，硕士生，研究方向为水生态毒理学， E-mail:zhoudx1927@gmail.com；

*通讯作者(Corresponding author)，E-mail:ypxu@rcees.ac.cn

10.7524/AJE.1673-5897.20140414001

2014-04-14 录用日期：2014-05-23

1673-5897(2015)1-281-07

X171.5

A

许宜平(1979—)，女，环境科学博士，副研究员，主要研究方向为环境水化学和环境风险评估，发表学术论文30余篇。

周东星, 许宜平, 王子健. 应用生物模拟采样法快速评估水中邻苯二甲酸酯的生物富集性[J]. 生态毒理学报, 2015, 10(1): 281-287

Zhou D X, Xu Y P, Wang Z J. Rapid evaluation of bioconcentration potential for esters using a biomimetic sampler [J]. Asian Journal of Ecotoxicology, 2015, 10(1): 281-287 (in Chinese)