不同培养方式及换水频率对坛紫菜(Porphyrahaitanensis)自由丝状体生长及藻胆蛋白含量的影响

丁兰平，颜泽伟，张全亮，徐佩杭，黄冰心*

(1. 汕头大学 海洋生物研究所，广东 汕头 515063)

不同培养方式及换水频率对坛紫菜(Porphyrahaitanensis)自由丝状体生长及藻胆蛋白含量的影响

丁兰平1，颜泽伟1，张全亮1，徐佩杭1，黄冰心1*

(1. 汕头大学 海洋生物研究所，广东 汕头 515063)

本实验以坛紫菜自由丝状体为材料，研究不同培养方式(静置、摇床、通气)和换水频率(5 d、7 d、10 d、20 d)对丝状体生长及藻胆蛋白(PE、PC)含量变化的影响。研究结果表明：坛紫菜自由丝状体在摇床培养条件下生长较好，特定生长速率可达10.832 7%～10.891 5%；摇床培养下的丝状体PE含量相对静置培养的较高一些，通气培养的相对较低，最高为36.816 8 mg/g；静置条件下培养的丝状体PC含量最高，摇床培养次之，通气培养最低，最低为1.082 4 mg/g。相同培养方式下，换水频率对丝状体特定生长速率影响不大；除通气培养外，换水频率20 d其PE、PC含量较高。方差分析结果表明：实验范围内的培养方式及换水频率对丝状体特定生长速率大小、PE和PC含量不存在交互作用。本文实验结果对坛紫菜自由丝状体产业化应用于食品加工、色素提取等产业提供了实验理论和依据。

丝状体；特定生长率；藻红蛋白；藻蓝蛋白；培养方式；换水频率

1 引言

大型海藻资源丰富，是食品、农业化肥、化工等领域的重要原料，对海洋药物的开发利用也有积极作用[1—2]。其中，大型海藻的主要类群——红藻，含有丰富的藻胆蛋白，是一类具有生物活性的天然色素，主要包括藻红蛋白(Phycoerythrim，PE)、藻蓝蛋白(Phycocyanin，PC)和别藻蓝蛋白(Allphycocyanin，APC)3类，能分别呈现出天然的红色、蓝色和紫罗兰色荧光，颜色鲜艳，色泽亮丽，因而欧美等发达国家将其作为食品色素和化妆品添加剂[3—5]。藻胆蛋白也可作为荧光探针、光敏剂及免疫调节物质，应用于荧光免疫检测、双色或多色荧光分析、杀伤肿瘤或抑制肿瘤细胞及治疗过敏性哮喘等[3,6—7]。

目前提取分离藻胆蛋白的原材料主要是红藻和蓝藻，不同藻种所含有的藻胆蛋白种类和数量有所差别[7]。但大型海藻人工栽培或直接获取受地理、气候、季节影响较大，且体内化合物成分复杂，因而难以作为稳定可靠的原材料供工厂化利用。丝状体是紫菜孢子体阶段一个重要时期，自20世纪Drew﹑曾呈奎等人阐明了紫菜生活史以来，已有多位国内外学者开展了紫菜自由丝状体生产应用研究[8—11]。与紫菜叶状体相比，其丝状体藻胆蛋白含量高、细胞成分简单，提取分离相对容易[12]。因而可将高蛋白的丝状体作为食品组分，添加到大众化、销量大的食品(如饼干)中，提高食品营养和保健功能，有利于提高丝状体的食品和药用价值；也可将丝状体功效组分，如藻胆蛋白分离纯化出来，开发医用药品、免疫活性物质等高值化产品。然而，目前将丝状体直接应用于海藻功能食品、藻胆蛋白提取的研究相对较少[12]。

目前，利用不同培养方式快速获得大量丝状体成为研究热点之一。朱建一等比较了悬浮培养和静止培养的自由丝状体，认为悬浮培养更有利于生产应用[13]；Zhang等利用自制的300 mL鼓泡式光生物反应器悬浮培养坛紫菜自由丝状体，优化培养过程参数，从而获得最大生长速率[14]；邓祥元等比较了鼓泡式光生物反应器和气升式环流光生物反应器对坛紫菜丝状体生长的影响，认为后者可获得更大生物量[15]。更换反应体系培养液，可防止因营养物质的耗竭和代谢毒产物的积累引起丝状体细胞生长过早进入衰退期而造成死亡现象发生，保持丝状体在较高的浓度水平。然而，关于换水频率对丝状体影响的直接研究较少，主要集中在不同磷源、氮磷、营养盐及氮磷比等对其生长发育的影响[16—18]。

本文研究了静置、摇床和通气等不同培养方式以及5 d、7 d、10 d、20 d等不同换水频率对坛紫菜自由丝状体生长和藻胆蛋白积累的影响，优化了自由丝状体在不同培养方式和不同换水频率下的培养条件，以期为坛紫菜自由丝状体产业化应用于食品加工、色素提取等产业提供理论依据。

2 材料与方法

2.1 实验材料

汕头大学海洋生物研究所重点实验室藻种室选育的坛紫菜自由丝状体品系(丝状藻丝大于99%)，其叶状体2012年采于汕头南澳平屿。自由丝状体用打碎机打碎20 s，20℃培养间(±2℃)暂养，光照16 μmol/(m2·s)、光周期为12 h∶12 h，每7 d更换一次培养基。待长到合适量用于实验。

2.2 实验方法

2.2.1 实验设计

培养方式(A)设静置、摇床、通气培养3个水平，换水频率(B)5 d、7 d、14 d、20 d(即不换水)4个水平，双因子3×4个组合处理，每个组合设置3组重复。各实验组按丝状体初始密度(0.28±0.05) g/(400 mL)接种到500 mL锥形瓶。分别放到20℃培养间(±2℃)培养，其中静置培养每天轻摇培养瓶两次(早上9：00，下午5：00)；摇床培养设置转速为137 r/min；通气培养通入的气体量以藻丝悬浮生长为准，期间每天两次摇动培养瓶(早上9：00，下午5：00)，使部分粘附在气石表面或瓶底的丝状体重新悬浮，通入的气流都预先经过硫酸铜溶液和纯净水除菌。调节与光源距离，设置光强为20 μmol/(m2·s) ，光强以最大表面照射为准，光暗比12 h∶12 h。所用的都为取自汕头、暗沉淀半个月以上天然海水，粗海盐将盐度调至30，再经过0.45 μm微孔滤膜过滤、高温灭菌之后，以每1 000 mL灭菌海水添加1 mL f1培养液的比例配制成培养丝状体的海水。培养至20 d后结束实验，测定丝状体鲜重、PE及PC含量。

2.2.2 测量方法

丝状体鲜重(Fresh weight，FW)测定：实验初始对丝状体进行称重。丝状体用筛绢过滤后静置10 min，电子天平称重，按以下公式计算特定生长速率(Specific growth rate ，SGR)：

(1)

其中W0为初始 FW，Wt为t天后的 FW，t为培养天数。

藻红蛋白(PE)及藻蓝蛋白(PC)含量测定：所有坛紫菜自由丝状体样品都经-20℃冰箱冷冻过夜，再由真空冷冻干燥72 h过。称取0.1(±0.01)g丝状体样品加入少量磷酸缓冲液(0.1 mol·L-1pH=6.8)冰浴研磨至匀浆状态，转入离心管用磷酸缓冲液补足到5 mL，4℃下5 000 r/min离心10 min。藻红蛋白(PE)、藻蓝蛋白(PC)含量计算参考Beer和Eshel[19]的方法测定。藻胆蛋白的光吸收值均使用岛津紫外可见分光光度计 UV—2501 测定。

2.3 数据处理

实验数据用Excel 2010计算，作图及统计分析使用GraphPad Prism 5.00软件。

3 结果与分析

3.1 培养方式及换水频率对坛紫菜自由丝状体SGR的影响

不同培养方式及换水频率条件下丝状体SGR的变化如图1所示。从图可知，相同换水频率下丝状体SGR在不同培养方式下的差异较大，各摇床培养组保持较高的SGR，最高为10.891 5%(摇床培养，10 d)；通气培养条件下除了5 d组外其他3组SGR较低，最低至6.251 17%(通气培养，10 d)。而相同通气方式培养下各换水频率组SGR差异性不大。方差分析表明：相同换水频率下，静置培养组的SGR和摇床培养组的有显著差异(p<0.05)；换水频率在7 d、10 d、20 d时，摇床培养组和通气培养组有极显著差异(p<0.01)。由此可见，在实验范围内，不同培养方式会影响丝状体的生长，但在本实验中，培养方式和换水频率双因子对丝状体生长的交互影响不显著。

图1 培养方式及换水频率对坛紫菜自由丝状体SGR的影响Fig.1 Cultivation methods and the frequency of the medium on SGR of free living conchocelis of P.haitanensis

3.2 培养方式及换水频率对坛紫菜自由丝状体PE的影响

图2所示为不同培养方式及换水频率条件下丝状体PE含量的变化。不同换水频率下各摇床培养组PE含量最高，最高为36.816 8 mg/g(摇床培养，20 d)，静置培养组次之，通气培养组PE含量最低，最低为9.846 79 mg/g(通气培养，7 d)。方差分析表明：通气培养下，5 d的换水频率同7 d的有极显著差异(p<0.01)；10 d的换水频率下，通气培养分别同静置培养和摇床培养的丝状体PE含量达到极显著差异(p<0.01)；20 d的换水频率条件下，摇床培养和通气培养的丝状体PE含量有显著差异(p<0.05)。在实验范围内的培养方式及换水频率，两者对丝状体PE含量的影响不存在相互作用(p>0.05)。

图2 培养方式及换水频率对坛紫菜自由丝状体PE的影响Fig.2 Cultivation methods and The frequency of the medium on PE of free living conchocelis of P.haitanensis

3.3 培养方式及换水频率对坛紫菜自由丝状体PC的影响

不同培养方式及换水频率条件下丝状体PC含量的变化如图3所示。从图可看出，静置培养组丝状体PC含量最高，最高为3.836 2 mg/g(静置培养，20 d)；通气培养组的含量最低，低至1.082 4 mg/g(通气培养，7 d)。方差分析表明：通气培养下换水频率5 d和7 d有显著差异(p<0.05)；静置培养和摇床培养的丝状体PC含量在换水频率为20 d有显著差异(p<0.05)；换水频率10 d、14 d及20 d下静置培养和通气培养的丝状体PC含量达到显著或者极显著差异(p<0.05或p<0.01)；静置培养和通气培养的丝状体PC含量有极显著差异(p<0.01)。培养方式及换水频率对坛紫菜丝状体PC含量的影响也无交互作用。

图3 培养方式及换水频率对坛紫菜自由丝状体PC的影响Fig.3 Cultivation methods and The frequency of the medium on PC of free living conchocelis of P.haitanensis

4 讨论

4.1 培养方式及换水频率对坛紫菜自由丝状体生长的影响

近年来自由丝状体应用于生产育苗成为了研究的热点，利用温度、盐度、光照和光周期等生态因子调控其生长发育的报道较多[20]，但本文研究的不同培养方式及换水频率对自由丝状体生长的影响却鲜有报道。本研究通过对比不同培养方式和换水频率的坛紫菜自由丝状体SGR大小、PE和PC含量，旨在为自由丝状体放大培养和应用到食品添加剂和生物活性物质等新兴产业提供重要依据。

相同培养条件下不同培养类型对丝状体SGR具有显著的影响。摇床培养较其他两种培养方式易获得更高的SGR，通气培养同静置培养的相差不大。这种差异可能与培养过程产生的流体剪切力有一定的关系。摇床培养的流体层间产生剪切力较弱，保持培养瓶良好的固液混合状态和藻丝的分散性，使藻丝受到的光照和营养吸收较均匀，有利于提高藻丝的SGR。张美如等[21]认为通气培养的丝状体较静置培养的有更高的生长率，这可能与培养体系大小与藻丝培养密度有一定关系，高密度和较大培养体积下通气效果可能会更好。本实验反应体系较小，通气量低易导致培养体系中部分地区湍流性不高，需要提高通气速率使藻丝悬浮生长，但过高的通气速率会对细胞产生过度剪切胁迫和氧胁迫，从而对植物细胞造成不同程度的影响[22]。且气液交界面气泡的破裂会将絮状丝状体溅到瓶壁，造成生物量的减少，所以有必要进一步探究通气量和培养体系大小对丝状体生长的影响，优化丝状体工厂化培养条件。

海藻的生长不仅与其生长状况有关，还受到外界营养盐浓度的影响[23]。更换实验体系培养液可增加外源营养盐，同时也可去除由藻丝代谢过程中产生的各种废物，使得藻丝能够保持良好的生长状态。本实验中，各不同换水频率组间的SGR差异性不大，可能是红毛菜科的海藻相对于绿藻等而言对营养盐的吸收较差[24]，且实验体系中接种藻丝的生物量较少，藻丝内部对营养盐吸收竞争较小，并不是影响其生长的重要因素，营养盐的浓度相对藻丝的生物量而言过于饱和。实验体系生物量少且反应体系较大，可减少换水频率。研究实验生物量多少、反应体系大小和换水频率快慢，将有效合理利用人力、物力，达到资源利用最大化的目的。

4.2 培养方式及换水频率对坛紫菜自由丝状体PE和PC含量的影响

藻胆蛋白是红藻的捕光色素蛋白，它的含量高低与其光合作用密切相关[25]。在本实验条件下，摇床培养组PE含量相对静置培养组的相对较高，通气培养组的相对较低；静置培养组PC含量最高，摇床培养组次之，通气培养组最低，但生长速率却是摇床培养组最高，静置培养组比通气培养组较高。这说明自由丝状体的生长速率与藻胆蛋白含量并非完全正相关。在培养方式发生改变时，摇床培养组PE含量略高于静置培养组，摇床培养组PC含量却低于静置培养组。可能是藻红蛋白在实验环境改变时，其蛋白质二级结构水平上关键区域的稳定性高于其他非关键区域，多肽链的柔性排列使藻红蛋白在环境发生改变时保持稳定的光谱特性，且藻红蛋白在变形过程中其内部荧光的传递能力高于藻蓝蛋白[26]。

海藻具有丰富的内部营养库，能够在饥饿的状态下生存较长时间，且海藻具有通过调节营养盐水平防止细胞成分发生剧变的能力[23,27]。Hannach认为紫菜叶状体在营养盐浓度提高情况下会合成更多的光合色素，主要包括藻胆蛋白，而丝状体可能利用藻胆蛋白作为氮的储存库[28]。通气培养过程中产生的剪切力破坏了丝状体的聚集状态，造成正常细胞的损伤，可能进而影响了藻丝对外界营养盐的正常吸收。尽管外界营养盐浓度较高，但当丝状体对外界营养盐的吸收受阻时，可能会先开始消耗内部氮存储，以维持自身的正常生长，造成藻体内部藻胆蛋白含量的下降。而换水频率5 d组SGR大小、PE和PC含量之间的差异性相对于其他组不大，可能是持续性的换水能提供外源营养和去除代谢废物，一定程度上能缓和通气培养造成的损伤。

本实验结果表明不同培养方式对丝状体的生长及藻胆蛋白含量能产生一定的影响，可在人工调控下促进目标色素的合成和积累。摇床培养可在短时间内获得较大生物量，保持丝状体良好生长状态，但摇床培养存在耗能大、难以放大等问题，因而可将摇床培养作为丝状体的一级扩增培养。换水频率应与培养体系、接种量等结合考虑，将可为藻种提供适量外源营养和排除代谢过程中产生的废物，保持其良好生长状态，且可有效利用环境资源，达到可持续发展的目的。

致谢：感谢课题组的孙国栋、李雯诗和曾令昭等同学在实验室工作及论文撰写方向给予的建议和帮助。

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Influence of cultivation methods and the frequency of the medium on the growth and phycobiliprotein content of free living conchocelis ofPorphyrahaitanensis

Ding Lanping1，Yan Zewei1，Zhang Quanliang1，Xu Peihang1，Huang Bingxin1

(1.MarineBiologyInstitute，ShantouUniversity，Shantou515063，China)

The cultivation methods ( standing, rocking, ventilating) and the frequency in changing water (once in 5 d, 7 d, 10 d, 20 d ) were studied on influence of the growth and phycobiliprotein ( PE, PC) content of free living Conchocelis ofPorphyrahaitanensis. The results show that under the condition of rocking, its growth is better, which SGR can reach 10.832 7%-10.891 5%; and its PE content is higher than that of under the condition of standing but lower than that of under the condition of ventilating, and the highest value is 36.816 8 mg/g. Under standing, the PC content reaches the highest, which higher than that of under rocking, and it reaches the lowest under ventilating with value 1.082 4 mg/g. Under the same culture way, the frequency in changing water does not much affect the SGR of free living Conchocelis. However, when the frequency is once in 20 d, its PE and PC contents are higher than other frequency except those of under the condition of ventilating. The ANOVA results show that interaction between the culture methods and water changing frequency does not exist on the SGR, PE and PC content of the conchocelis. It provides an experimental and theoretical basis for free living Conchocelis ofPorphyrahaitanensisapplying to industrial application in food processing and pigment picking industry.

conchocelis; SGR; PE; PC; culture methods; frequency of the medium

10.3969/j.issn.0253-4193.2015.06.012

2014-07-31；

2015-03-30。

国家科技支撑项目(2012BAC07B05)；国家自然科学基金(31270257)；广东省科技计划项目(2011B031100010，2012A020200007)；广东省高等学校人才引进项目(2011年)；汕头市科技计划项目(2012-171)。

丁兰平(1969—)，男，湖北省蕲春县人，教授、研究员，研究方向为海藻学。E-mail:lpd2118@hotmail.com

*通信作者：黄冰心(1974—)，女，福建省莆田市人，副教授，主要研究方向为海洋生物技术及藻类资源利用。E-mail：bxhuang@stu.edu.cn

S917.3

A

0253-4193(2015)06-0114-06

丁兰平，颜泽伟，张全亮，等. 不同培养方式及换水频率对坛紫菜(Porphyrahaitanensis)自由丝状体生长及藻胆蛋白含量的影响[J].海洋学报，2015，37(6)：114—119，

Ding Lanping，Yan Zewei，Zhang Quanliang，et al. Influence of cultivation methods and the frequency of the medium on the growth and phycobiliprotein content of free living conchocelis ofPorphyrahaitanensis[J]. Haiyang Xuebao，2015，37(6)：114—119，doi：10.3969/j.issn.0253-4193.2015.06.012