紫杉醇对宫颈癌TC-1细胞表面PD-L1表达的影响*

杨静，肖肖，魏洁，寇蓬，杨丽华

(昆明医科大学第二附属医院妇科，昆明 650000)

紫杉醇对宫颈癌TC-1细胞表面PD-L1表达的影响*

杨静，肖肖，魏洁，寇蓬，杨丽华

(昆明医科大学第二附属医院妇科，昆明 650000)

目的 探讨紫杉醇对宫颈癌TC-1细胞程序性凋亡配体1(PD-L1)表达的影响及其机制。方法 ①将细胞分为紫杉醇组及紫杉醇联合蛋白激酶D(PKD)阻断药(GÖ6976)，每组设4个浓度梯度，各5个复孔，分别加入对应浓度试剂，MTT法检测紫杉醇对TC-1细胞活力的影响及GÖ 6976对紫杉醇IC50值的影响。②将细胞分为0.9%氯化钠溶液组及紫杉醇组，每组5个复孔，分别加入对应浓度试剂，免疫组化法检测紫杉醇对TC-1细胞PD-L1表达的影响。③将细胞分成阴性对照组、GÖ 6976组、紫杉醇组、紫杉醇联合GÖ 6976组4组，每组5个复孔，分别加入对应浓度试剂，免疫组化法检测紫杉醇、GÖ 6976对TC-1细胞PD-L1表达的影响。 结果 紫杉醇组紫杉醇对TC-1 细胞的IC50值为40.0 μg·mL-1，紫杉醇联合GÖ 6976组紫杉醇对TC-1细胞IC50值为38.9 μg·mL-1，两组IC50值差异无统计学意义(P>0.05)。紫杉醇处理TC-1细胞24 h后PD-L1的表达为(88.48±13.44)%，显著高于阴性对照组(39.59±5.99)%(P<0.05)。紫杉醇联合GÖ 6976处理TC-1细胞24 h后PD-L1表达为(79.7±4.7)%，显著低于紫杉醇组(96.8±2.5)%(P<0.05)。 结论 紫杉醇可增加TC-1细胞PD-L1表达，阻断PKD途径可显著抑制PD-L1表达增加的程度，紫杉醇可能是通过PKD途径发挥作用。

紫杉醇；程序性凋亡配体1；蛋白激酶D；癌，宫颈

紫杉醇是宫颈癌常用的化学治疗(化疗)药物[1]。肿瘤化疗效果除了与肿瘤细胞对化疗药物敏感性有关外，还与机体免疫状态有关，机体免疫抑制或免疫逃逸是影响化疗效果的主要原因之一[2]。T淋巴细胞的一种阴性调节信号分子程序性凋亡配体(programmed death ligand-1，PD-L1)是近年来发现的与肿瘤免疫逃逸相关的重要分子之一[3]。PD-L1与T淋巴细胞受体表面程序性凋亡受体(programmed death-1 receptor，PD-1)结合，提供抑制性信号，导致T调节细胞(T regulate cells，Treg) 活性增强及抗肿瘤T 细胞失能，抑制T细胞的分化和增殖，诱导T细胞失能或凋亡[4]。PD-L1在慢性持续感染、肿瘤等病理情况下表达可增加，导致机体免疫抑制疾病进展。有研究表明，内源抗肿瘤介质如干扰素γ(interferon-γ，INF-γ)或抗肿瘤治疗诱导下某些肿瘤细胞可表达PD-L1，抑制T淋巴细胞活性，从而影响治疗效果[5]。笔者尚未见紫杉醇对宫颈癌细胞PD-L1表达影响的研究。本研究通过免疫组化研究紫杉醇对宫颈癌TC-1细胞表面PD-L1表达的影响及其可能机制，以期为提高宫颈癌化疗效果提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 细胞、试剂及仪器 细胞株：鼠肺上皮细胞株TC-1，是鼠源性的人乳头瘤病毒16(human papillomavirus 16，HPV16)阳性的肿瘤细胞株，由美国约翰霍普金斯大学医学院TC WU教授惠赠。兔抗鼠PD-L1多克隆抗体购自北京博奥森生物技术有限公司，噻唑蓝(methyl thiazolyl tetrazolium,MTT)购自碧云天生物技术研究所，二甲亚砜(dimethyl sulfoxide,DMSO)购自Gibco，GÖ 6976购自Sigma，紫杉醇购自海南制药厂，SP免疫组化试剂盒和二氨基联苯胺(diaminobenzidine,DAB)显色试剂盒购自康为世纪。超净工作台(苏州净化设备厂，SPEG AIR TECH)；微量加样器(德国Eppendorf，2.5～1 000 μL)；光学显微镜、倒置相差荧光显微镜(德国Leica公司)，24，96孔板(Costar公司 3524 3599)；酶联免疫检测仪(美国Thermo Model 2550 EIA reader)。

1.2 细胞培养 TC-1细胞培养于含10%胎牛血清、青霉素、链霉素浓度均为100 U·mL-1的DMEM培养液，置于 5%二氧化碳、饱和湿度、37 ℃恒温培养箱内培养。常规换液传代，取对数生长期的细胞进行实验。

1.3 MTT法检测紫杉醇对TC-1细胞活力的影响及蛋白激酶D(protein kinases D，PKD)阻断药GÖ 6976对紫杉醇IC50值的影响 将细胞分为紫杉醇组及紫杉醇联合GÖ 6976组，TC-1细胞接种于 96 孔板，每组分4个浓度梯度，每个梯度设5个复孔，紫杉醇组加含紫杉醇终浓度分别为10.0，18.0，32.4，58.3 μg·mL-1的培养液每孔150 μL，紫杉醇联合GÖ 6976组每孔均加入GÖ 6976 5 μmol·L-1，然后加含紫杉醇终浓度分别为10.0，18.0，32.4，58.3 μg·mL-1的培养液。两组均在24 h加MTT，4 h加DMSO，振荡、酶标仪测量吸光度(A)值，计算细胞存活率(%)=(实验组平均A值-空白孔A值)/(对照组平均A值-空白孔A值)×100%。

1.4 紫杉醇对TC-1细胞表面PD-L1表达的影响 将细胞分为0.9%氯化钠溶液组及紫杉醇组，每组设5个复孔，紫杉醇组加入含20.0 μg·mL-1紫杉醇的培养液，0.9%氯化钠溶液组加入含0.9%氯化钠溶液的培养液，每孔500 μL。24 h后免疫组化方法检测TC-1细胞表面PD-L1表达。具体方法为4%多聚甲醛固定细胞，3%过氧化氢封闭内源性过氧化物酶，滴加PD-L1多克隆抗体，4 ℃过夜后生物素化山羊抗兔二抗，室温孵育20 min。DAB显色，苏木精复染，观察、摄像。

1.5 GÖ 6976对紫杉醇引发的TC-1细胞表面PD-L1表达变化的影响 将细胞分成4组，每组设5个复孔，阴性对照组、GÖ 6976组、紫杉醇组、紫杉醇联合GÖ 6976组。阴性对照组加入含0.9%氯化钠溶液和DMSO的培养液，GÖ 6976组加入含5 μmol·L-1GÖ 6976的培养液，紫杉醇组加入含20.0 μg·mL-1紫杉醇的培养液，紫杉醇组+GÖ 6976组加入含20.0 μg·mL-1紫杉醇和含5 μmol·L-1GÖ 6976的培养液，24 h后同“1.4”项下方法，应用免疫组化方法检测TC-1细胞表面PD-L1表达。

1.7 统计学方法 采用SPSS17.0版统计软件对数据进行统计分析处理，计量资料比较采用独立样本t检验、单因素方差分析，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 紫杉醇对TC-1细胞活力的影响及GÖ 6976对紫杉醇IC50值的影响 紫杉醇组细胞的抑制率平均9.0%，10.4%，41.3%，62.5%。紫杉醇对TC-1细胞的增殖具有抑制作用，且呈浓度依赖性，紫杉醇对TC-1细胞的IC50为40.0 μg·mL-1。紫杉醇联合GÖ 6976组细胞的抑制率平均为9.2%，11.2%，42.1%，61.6%，紫杉醇对TC-1细胞的IC50值为38.9 μg·mL-1。两组IC50值差异无统计学意义(P>0.05)。

2.2 紫杉醇对TC-1细胞表面PD-L1表达的影响 PD-L1主要表达在细胞的细胞膜和胞质内，呈棕黄色至棕褐色颗粒或团块，多区域分布。紫杉醇处理24 h后TC-1细胞表面PD-L1的表达为(88.48±13.44)%，阴性对照组为(39.59±5.99)%，与阴性对照组比较，紫杉醇处理后的TC-1细胞表面PD-L1表达显著增加，差异有统计学意义(F=4.35，P<0.05)。见图1。

A.阴性对照组；B.紫杉醇组

图1 两组TC-1细胞表面PD-L1表达苏木精-伊红染色图(×200)

A.negative control group；B.paclitaxel group

Fig.1 HE staining on PD-L1 expression at cell surface of TC-1 in two groups(×200)

2.3 GÖ 6976对紫杉醇引起的TC-1细胞表面PD-L1表达变化的影响 与阴性对照组比较，紫杉醇组、紫杉醇联合GÖ 6976组细胞表面PD-L1的表达显著增高，而紫杉醇联合GÖ 6976组与紫杉醇组比较，细胞表面

PD-L1的表达显著降低，差异有统计学意义(F=4.06，P<0.05)。见图2，表1。

3 讨论

PD-L1过度表达与其免疫逃逸机制相关，PD-L1表达增加，与T细胞上的PD-1受体结合增加，传递的负性调控信号增多，导致活性增强及抗肿瘤T 细胞的凋亡和免疫无能，使肿瘤细胞逃避机体的免疫监控和杀伤，产生免疫逃逸。慢性持续感染、肿瘤等多种病理情况可出现PD-L1过度表达，影响肿瘤治疗效果。ZHANG等[6]报道紫杉醇、依托泊苷、5-氟尿嘧啶(5-Fu)诱导乳腺癌细胞表面PD-L1表达增加，促进PD-L1引起的T细胞凋亡，影响紫杉醇、依托泊苷、Fu对乳腺癌的抑制作用。QIN等[7]报道应用顺铂后肝癌细胞株H22过度表达PD-L1 。也有多位学者报道正常宫颈组织中不表达PD-L1，宫颈癌组织中PD-L1高表达，且细胞表面PD-L1的表达与癌细胞浸润深度明显相关[8]。本实验中笔者发现紫杉醇使TC-1细胞表面PD-L1的表达增加，提示应用紫杉醇后可增加PD-L1在肿瘤细胞的表达，这可能是影响紫杉醇化疗效果的原因之一。

QIN等[7]认为化疗药物顺铂使肝癌细胞上PD-L1表达增加是通过Erk /MAPK途径。CHEN等[5]发现干扰素γ通过蛋白激酶D2(PKD2)途径提高口腔鳞状细胞癌细胞表面PD-L1的表达。研究表明，PKD与肿瘤的生长、发展、迁移都有联系[9]。PKD家族存在于大多数真核细胞内，胞质、细胞核、高尔基体及线粒体内均有分布，在细胞间信息传递过程中发挥重要作用[10]。在本研究中，加入PKD阻滞剂后能减少紫杉醇增加肿瘤细胞表面PD-L1的增加程度，提示PKD途径参与了紫杉醇影响肿瘤细胞表面PD-L1表达增加这一过程。这一结果与干扰素增加肿瘤细胞表面PD-L1表达相似。

A.阴性对照组；B.GÖ 6976组；C.紫杉醇组；D.紫杉醇+GÖ 6976组

表1 4组TC-1细胞表面PD-L1的表达的比较

与阴性对照组比较，*1P<0.05；与紫杉醇组比较，*2P<0.05

Compared with negative control group，*1P<0.05；compared with paclitaxel group，*2P<0.05，

紫杉醇能显著抑制肿瘤细胞生长，本实验中也得出了相似的结果。本实验发现PDK阻断药能够显著减少紫杉醇增加肿瘤细胞表面PD-L1表达程度，为了探讨PDK阻断药是否可促进紫杉醇对TC-1细胞的抑制作用，用MTT法检测了PDK阻断药对于紫杉醇IC50值的影响，发现PDK阻断药未能改变紫杉醇对TC-1细胞的IC50值，说明紫杉醇对TC-1细胞的抑制作用与PDK阻断药无显著关系，提示PDK阻断药对于紫杉醇对TC-1细胞的影响是通过调节免疫因子，通过机体免疫效应发挥作用的。

因此，可推测阻断PKD途径可能阻断紫杉醇引起的肿瘤细胞表面PD-L1表达增加，抑制肿瘤细胞免疫逃逸，提高化疗效果，为提高紫杉醇化疗效果提供了理论依据。

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DOI 10.3870/yydb.2015.08.010

Effect of Paclitaxel on Expression of PD-L1 in Surface of Cervical Cancer TC-1 Cells

YANG Jing, XIAO Xiao, WEI Jie, KOU Peng, YANG Lihua

(DepartmentofGynaecology,theSecondAffiliatedHospitalofKunmingMedicalUniversity,Kunming650000,China)

Objective To investigate effect of paclitaxel on expression of programmed death ligand-1 (PD-L1) in the surface of cervical cancer TC-1 cells and its mechanism. Methods ①The cells were divided into two groups： paclitaxel group, paclitaxel combined with PKD blocker (GÖ 6976) group.There were 4 concentration gradient and 5 holes for each group, and each hole has its corresponding concentration of drugs.Influence of paclitaxel on TC-1 cell viability and effect of PKD blocker GÖ 6976 on IC50value of paclitaxel were evaluated by MTT method.②The cells were divided into 0.9% sodium chloride solution (NS) group and paclitaxel group, There were 5 holes of each group.Effect of paclitaxel on PD-L1 expression on the surface of TC-1 cells were measured by immunohistochemistry.③The cells were divided into 4 groups： NS+DMSO group, GÖ 6976 group, paclitaxel group and paclitaxel+GÖ 6976 group.There were 5 holes for each group.Effect of paclitaxel and GÖ 6976 on PD-L1 expression on the surface of TC-1 cells were measured by immunohistochemistry.The expressions of PD-L1 on the surface of cells were measured by immunofluorescence treated with different drugs. Results The IC50value of paclitaxel was 40.0 μg·mL-1in paclitaxel group, and 38.9 μg·mL-1in paclitaxel combined with PKD blocker GÖ 6976 group, without significant difference between the two groups (P>0.05).The expression of PD-L1 in the surface of TC-1 cells were significantly higher in paclitaxel group than in negative control group [(88.48±13.44)%vs.(39.59±5.99)%,P<0.05].The expression of PD-L1 in the surface of TC-1 cells was (79.7%±4.7)% after treatment with paclitaxel combined with PKD blocker GÖ 6976 for 24 h, and it was significantly lower than that in paclitaxel group [(96.8±2.5)%,P<0.05]. Conclusion Paclitaxel promotes the expression of PD-L1 in the surface of TC-1 cells, which could be significantly inhibited by blocking PKD pathway.Paclitaxel may exert its effect through PKD pathway.

Paclitaxel；Programmed death ligand-1；Protein kinases D；Cancer, cervical

2014-09-03

2015-01-09

*云南省科技厅应用基础研究面上基金资助项目(2012FB162)

杨静(1987-)，女，湖北荆州人，在读硕士，研究方向：妇科肿瘤。电话：(0)18163138117，E-mail：olivehope@163.com。

杨丽华(1972-)，女，云南丽江人，副教授，博士，研究方向：妇科肿瘤。电话：(0)13759481789，E-mail：13759481789@163.com。

R979.1；R737.3

A

1004-0781(2015)08-1028-04