不同激素配比对太行菊不定芽增殖与生长的影响

赵元增,杨靖,孙海燕

（河南科技学院,河南新乡453003）

不同激素配比对太行菊不定芽增殖与生长的影响

赵元增,杨靖,孙海燕

（河南科技学院,河南新乡453003）

以太行菊无菌不定芽为材料,改良MS（KNO3与KH2PO4用量加倍,其他成分维持不变）为基本培养基,通过添加不同种类（6-BA、NAA、KT、IBA）与用量的植物激素,研究了不同植物激素配比对太行菊不定芽增殖和生长的影响.结果表明：细胞分裂素6-BA较KT,生长素NAA较IBA更适宜太行菊不定芽的增殖与生长培养；培养基中6-BA与NAA不同质量浓度的组合对太行菊不定芽的增殖与生长产生较大的影响,当配以0.05 mg/L的NAA时,0.2 mg/L的6-BA较适宜太行菊不定芽的分化与增殖,而0.1 mg/L的6-BA较适合太行菊不定芽的生长和小苗的形成.

太行菊；不定芽；离体培养；增殖系数；植物激素

太行菊[Opisthopappus taihangensis（Ling）Shih]是菊科太行菊属多年生宿根草本植物,多生长于太行山区海拔1 000 m左右的悬崖峭壁、陡坡、裸露岩石的石缝中,生境险峻,土壤贫瘠,人常难以到达[1].由于分布区域狭窄,生境独特,繁殖能力弱,加之人为的私挖滥采,太行菊现处于濒危状态,已被列为国家珍稀濒危保护植物及河南省重点保护植物[2].与传统药用野菊相比,太行菊具有更好的保健或药用功效,其整株的开发利用潜力巨大[3-4].另外,作为菊花的野生近缘种,太行菊也是菊花杂交育种理想的材料[5].

近年来,出于对太行菊资源保护与综合开发的需要,对太行菊的遗传多样性[6-7]、生殖生物学[8-11]、远缘杂交[12-16]等的研究和报道日趋增多.但对太行菊离体繁殖领域的研究较少,仅见姚连芳等[17]、王建博等[18]、赵元增等[19-20]的少数报道.在这些有关太行菊组培的报道中,研究内容主要涉及太行菊外植体灭菌方法、愈伤组织诱导与分化、生根培养、基本培养基组成调整等问题[17-20],而植物激素对太行菊不定芽增殖与生长影响的研究,目前尚未见报道.不定芽的扩繁是太行菊组培苗工厂化生产中的关键环节,直接决定着生产的效率与成败,加深此环节的研究,是建立太行菊高效繁育体系的基础.

本文以太行菊离体不定芽为材料,以改良的MS培养基为基本培养基[19],研究了不同激素种类与用量对太行菊不定芽增殖与生长的影响,以便建立有效的太行菊离体繁殖技术体系,为太行菊种质资源的保护和开发利用奠定基础.

1 材料与方法

1.1 试验材料

太行菊采自新乡市关山国家地质公园,接种材料为太行菊无菌不定芽.KNO3、KH2PO4、蔗糖、琼脂粉等药品或试剂均购自上海晶纯生化科技股份有限公司,其中外源激素类试剂为细胞培养级,其他试剂均为分析纯（AR）.

1.2 试验方法

1.2.1 培养基以改良的MS培养基（KNO3、KH2PO4用量加倍,其他成分保持不变）为基本培养基,通过添加不同种类与质量浓度的外源激素调制不同的增殖培养基.所有培养基中均加入蔗糖30 g/L,琼脂粉4.6 g/L,pH调整为5.8,常规灭菌.

1.2.2 接种与培养在超净工作台上,选择长势及大小一致的太行菊不定芽块,将其切成1 cm3大小,分别接种于以上各培养基,每种培养基接种20瓶,每瓶接种3块.接种时不定芽块基部嵌入培养基,不定芽生长点要外露.置于（25±1）℃,光周期12 h/d,1 500~2 000 lx照度下培养.

1.2.3 调查项目与方法接种后7 d,定期观察、记录不定芽的增殖状况及其长势.培养40 d时,记录每个处理的接种不定芽块总数、芽块大小、不定芽长势（不定芽的叶色、叶片长度、叶片枯死情况等）、成苗数（有明显伸长的茎,株高大于20 mm的小苗）等结果.然后,将增殖后的不定芽块切割成与接种时的不定芽块一样大小（1 cm3）,统计各处理增殖后芽块的分割总块数,并计算各处理的增殖系数：不定芽增殖系数=增殖后芽块的分割总块数/接种芽块总数.

2 结果与分析

2.1 6-BA+NAA对太行菊不定芽增殖与生长的影响

在不同6-BA与NAA质量浓度配比的各培养基上,太行菊不定芽增殖与生长状况见表1.

表1 不同6-BA/NAA配比对太行菊不定芽增殖与生长的影响Tab.1 Effect of different 6-BA/NAA concentration proportion on proliferation and growth of Opisthopappus taihangensis adventitious buds

由表1可知,与添加激素的处理相比,在不添加任何激素的培养基（Ⅰ-1）上,太行菊不定芽的增殖与生长状况表现最差：很少有新芽分化,芽块小,增殖系数最低；芽块中出现大量枯死的不定芽和叶片,呈黄褐色至黑褐色,甚至整个芽块变褐枯死.因此,在太行菊不定芽的增殖培养中,培养基中添加一定剂量的植物激素是必需的.在添加激素的各培养基上,在一定质量浓度范围内,随着培养基中6-BA质量浓度的升高,芽块变大,不定芽分化数量增多,增殖系数升高,芽块中黄褐至褐色枯叶减少.在0.2 mg/L 6-BA配以0.05 mg/L NAA的培养基（Ⅰ-4）上,接种芽块分化产生大量不定芽,芽块大小与不定芽增殖系数均达到最大值.此外,该培养基上的不定芽生长正常,叶色鲜绿,长势旺盛,除较大叶片的叶缘与叶尖呈现黄色外,芽块中很少存在黄褐色至褐色的枯叶.当6-BA质量浓度达0.4 mg/L时（Ⅰ-5）,不定芽的增殖与生长状况总体与Ⅰ-4处理相近,所不同的是,在Ⅰ-5培养基上,不定芽增殖系数有所下降,芽块变小,芽块中黄褐色枯叶增多.

此外,在较低的6-BA质量浓度（＜0.1 mg/L）下,随着激素质量浓度的升高,不定芽生长趋于茁壮,每瓶中株高大于20 mm的小苗数也逐渐增加.当6-BA质量浓度为0.1 mg/L时,不仅形成的不定芽较大,每瓶可分离的小苗数也达到最多.但当6-BA质量浓度≥0.2 mg/L时,不定芽变小,每瓶中形成的小苗数也迅速减少.

由此可知,培养基中添加一定量的激素有利于太行菊不定芽的增殖与生长.当培养基中无激素时,不定芽分化数量少,且枯死严重；在0.05 mg/L NAA浓度下,0.2 mg/L的6-BA（Ⅰ-4）较适合太行菊不定芽的分化与增殖,而0.1 mg/L的6-BA（Ⅰ-3）较适合太行菊不定芽的生长和小苗的形成.

2.2 KT+NAA对太行菊不定芽增殖与生长的影响

KT与6-BA都是常用的细胞分裂素,对不定芽的分化与增殖都具有促进作用,但两者的作用效果常因植物类型的不同而存在差异.在不同KT与NAA质量浓度配比的各培养基上,太行菊不定芽增殖与生长状况见表2.

表2 不同KT/NAA配比对太行菊不定芽增殖与生长的影响Tab.2 EffectofdifferentKT/NAAconcentrationproportiononproliferationandgrowthofOpisthopappus taihangensis adventitiousbuds

由表2可知,随着KT质量浓度的提高,分化形成的不定芽增多,不定芽增殖系数呈上升趋势,而芽块中枯死叶片减少.但总体而言,在不同质量浓度的KT+NAA配比下,各处理的不定芽增殖系数、芽块大小、叶片大小等状况都差异不大.因此,与不同质量浓度的6-BA+NAA处理相比,不同质量浓度的KT+NAA处理对太行菊不定芽增殖与生长的影响相对较小.

当KT与6-BA质量浓度相同并配以对应质量浓度的NAA时,6-BA较KT更有利于太行菊不定芽的增殖.表现为：在使用6-BA的培养基上,分化产生的不定芽更多,芽块更大,不定芽增殖系数明显提高,芽块中枯死叶片数量有所减少.而在相同质量浓度的KT条件下,芽块相对蓬松,不定芽数量少,芽块中夹杂的黄褐色枯叶较多.值得注意的是,在含不同质量浓度KT的各培养基上,均有一定数量小苗的形成,且小苗生长茁壮,有些小苗株高可达40~50 mm.

2.3 6-BA+IBA对太行菊不定芽增殖与生长的影响

IBA也是常用的生长素,其作用活性较NAA要弱,但在有些植物的离体培养中,IBA较NAA更有利于不定芽的茁壮成长与根的分化[21].为了弄清IBA是否更适合太行菊不定芽的增殖与生长,进行了不同质量浓度IBA+6-BA组合试验,结果见表3.

表3 不同6-BA/IBA配比对太行菊不定芽增殖与生长的影响Tab.3 Effect of different 6-BA/IBA concentration proportion on proliferation and growth of Opisthopappus taihangensis adventitious buds

由表3可知,在相同6-BA质量浓度的条件下,不同质量浓度的IBA处理,不定芽的增殖与生长状况相差不大,芽块大小、不定芽增殖系数、芽块中枯叶多少等参数在不同处理间都相近.同使用NAA的处理Ⅰ-3相比,在各6-BA/IBA配比的培养基上,芽块中有较多的不定芽叶片呈现黄褐色,不定芽枯死较重.另外,在含IBA的各培养基上,形成的小苗数量也较Ⅰ-3处理要少,并且这些小苗植株低矮,生长纤弱,长势较差.

因此,在太行菊不定芽的离体培养中,同NAA相比,在使用IBA的各培养基上,太行菊不定芽的生长状况较差,不定芽枯死较重,芽块上可分离的株高大于20 mm的小苗数量也很少.并且在含IBA的各培养基上,不定芽的分化与增殖也不具有明显的优势.因此,在太行菊的离体培养中,不宜选择IBA与6-AB配合使用用于不定芽的增殖与生长.

3 结论与讨论

在植物的离体培养中,培养基中激素（尤其是细胞分裂素和生长素）的种类与配比是调控不定芽分化与生长的关键.若植物激素种类不当或浓度较低,常会导致不定芽分化数量少、增殖率低,甚至引起不定芽黄化、死亡；但激素浓度过高,也会导致分化的不定芽密集、纤弱,易出现畸形、玻璃化等问题[21-22].在已发表的太行菊的组织培养研究中,姚连芳等[17]发现,在高质量浓度6-BA（2.0 mg/L）的MS培养基上,初代培养的太行菊顶芽或茎段常形成愈伤组织,有些外植体虽有不定芽的分化,但形成的不定芽细小,与米粒状愈伤组织的大小相当.而在王建博等[18]的研究中,在6-BA质量浓度为1.0~2.0 mg/L的丛生芽诱导培养基上,继代培养的组培苗呈现半透明状的玻璃化.这些研究虽没有涉及太行菊不定芽的增殖培养,但他们的初代与继代培养结果预示着,在太行菊的离体培养中不宜采用较高浓度的植物激素.我们在前期的预备性试验中也发现,较高的激素浓度,特别是较高的细胞分裂素质量浓度（6-BA,0.5~2.0 mg/L）虽能促进太行菊不定芽的大量分化,但形成的不定芽细小,叶片黄枯较重,且激素浓度越高,这种状况越重.在自然生长环境中,太行菊的侧芽萌发能力本身很强,单株形成众多分枝,分枝上可再生分枝,形成簇生的单株.从其自然生长特性来看,在太行菊的离体培养中,植物激素的使用浓度也应不宜过高.本文试验结果也进一步验证了这一点：当配以低质量浓度NAA的情况下,0.2 mg/L的6-BA即已满足太行菊不定芽增殖与生长的需要,不定芽分化数量与长势均表现最优；当6-BA质量浓度达0.4 mg/L时,芽块变小,不定芽增殖系数下降,芽块中黄褐色枯叶增多.

不过,在离体培养的特殊环境下,培养基中添加一定浓度的激素对太行菊不定芽的增殖与生长仍是必需的,否则将致使不定芽分化稀少,芽块变褐枯死十分严重.在质量浓度为0.1 mg/L的6-BA作用下,虽然不定芽的分化增殖达不到理想状态,但形成的不定芽较大,每瓶中可分离的小苗数达到最多（3.27株/瓶）,远远高于6-BA质量浓度为0.2 mg/L的处理（0.55株/瓶）.若在维持一定不定芽增殖率的同时,想要获得较多的小苗用于生根移栽,培养基中添加0.1 mg/L 6-BA是较为理想的选择.

虽然KT与6-BA、NAA与IBA分别是常用的细胞分裂素类和生长素类,但不同的植物种类在离体培养中,偏好的激素种类有所不同.本文试验结果表明,与对应质量浓度的KT相比,使用6-BA的处理不定芽增殖率更高,而不定芽叶片枯死状况更轻.虽然在含不同质量浓度KT的培养基上均有一定小苗的形成,但数量不多,均低于含0.1 mg/L 6-BA的处理.在细胞分裂素6-BA质量浓度一定的条件下,与使用NAA的处理相比,使用IBA的各处理最突出的劣势是：芽块中不定芽生长纤弱,叶片黄化与枯死严重.因此,在太行菊的离体培养中,不宜选择KT、IBA用于不定芽的增殖与生长培养.

综上所述,在太行菊不定芽的离体培养中,培养基中添加一定量的植物激素是必需的,当培养基中无激素时,不定芽分化数量少,且不定芽枯死严重；细胞分裂素6-BA较KT,生长素NAA较IBA更适合太行菊不定芽的增殖与生长培养；当配以较低质量浓度NAA（0.05 mg/L）时,0.2 mg/L的6-BA较适合太行菊不定芽的分化与增殖,而0.1 mg/L的6-BA较适合太行菊不定芽的生长和小苗的形成.

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（责任编辑：邓天福）

Effect of different hormone combinations on adventitious buds proliferation and growth of Opisthopappus taihangensis in vitro

Zhao Yuanzeng,Yang Jing,Sun Haiyan
（Henan Institute of Science and Technology,Xinxiang 453003,China）

The effect of different combinations of plant hormones on adventitious buds proliferation and growth of Opisthopappus taihangensis were studied on different media based on the modified MS medium（content of KNO3, KH2PO4doubled and other component unchanged）containing different types and concentration of hormone（6-BA, NAA,KT and IBA）.The results showed that：hormone 6-BA and NAA,in comparison with KT and IBA,were more suitable for proliferation and growth of O.taihangensis adventitious buds.The hormone combination of 6-BA and NAA with different concentration had a significant impact on adventitious buds proliferation and growth of O. taihangensis.Under the same concentration of 0.05 mg/L NAA,the cytokinin 6-BA at a concentration of 0.2 mg/L was more suitable for proliferation and differentiation of adventitious buds,whereas 0.1 mg/L 6-BA was recommendable for growth and development of adventitious buds of O.taihangensis.

Opisthopappus taihangensis；adventitious buds；culture in vitro；propagation coefficient；plant hormone

S682.1+1

A

1008-7516（2015）03-0016-05

10.3969/j.issn.1008-7516.2015.03.004

2015-04-15

河南省教育厅科学技术研究重点项目（14B210005）；河南科技学院博士科研启动基金（201010612002）

赵元增（1974―）,男,山东蒙阴人,博士,副教授.主要从事植物细胞工程与遗传育种研究.