大豆连作土壤线虫群落结构的影响

2015-06-12王进闯王敬国

植物营养与肥料学报 2015年4期

关键词：根际线虫群落

王进闯，王敬国

(1中国农业大学资源与环境学院，农业部植物营养学重点实验室，北京 100193;2中国热带农业科学院环境与植物保护研究所，海南海口 571101)

大豆连作土壤线虫群落结构的影响

王进闯1, 2，王敬国1*

(1中国农业大学资源与环境学院，农业部植物营养学重点实验室，北京 100193;2中国热带农业科学院环境与植物保护研究所，海南海口 571101)

连作；大豆；线虫群落； T-RFLP；定量PCR

土壤健康是农产品产量和品质的重要保证，而土壤生物的群落结构决定了土壤的健康状况，土壤生物群落结构的变化可作为土壤变化的早期预警生态指标[1]。线虫群落包括不同营养类群：植物寄生线虫、食细菌线虫、食真菌线虫、捕食性和杂食性线虫，是土壤动物中数量最多、功能最丰富的一类[2]。线虫影响着土壤有机质分解和养分循环以及病害的发生，被认为是土壤健康状况的敏感性指示生物[3]。

通常研究土壤线虫群落结构的方法是形态分类，这需要具有分类经验的专业技术人员，而且在鉴定上费时费工，很难在短期内获得结果[15]。同时，鉴定的结果往往是在属、科和营养类群的水平，使生态分析往往比较模糊或表面化[16]。形态分类的另一个缺点是只能鉴定成虫标本，而成虫仅是全部线虫群落的很小的一部分[17]，不能全面反映土壤的线虫状况。利用分子生物学方法的一个优点是不必分离和培养线虫，仅通过设计引物就可以鉴定一个土壤系统中的线虫群落。末端限制性片段长度多态性分析(T-RFLP)已被证实是研究不同生境中线虫群落的有效方法[18-21]。

本文利用T-RFLP和qPCR技术，研究了长期大豆连作根际土壤中线虫群落的结构和丰度的变化，特别是比较短期连作和长期连作线虫群落的差异。另外，通过相关性分析，确定引起土壤线虫群落变化的主要驱动因子，有助于理解长期连作大豆土壤线虫群落的变化规律。

1 材料与方法

1.1 试验区概况

1.2 大豆品种

供试大豆材料为合丰25号。选用的品种适应性强，且茎秆坚韧、节间短小、结荚密实，因而它有适应性强、高产和早熟等优良特性。目前，合丰25号是黑龙江省主要的种植品种。2009年4月，开始种植大豆，播种密度为每平方米30颗种子，每个样地包括10行(长×宽为15 m×0.67 m)，按当地推荐的施肥量施用底肥(N 50 kg/hm2、P 45 kg/hm2和K 50 kg/hm2)。

1.3 土壤样品采集与制备

在试验田采用“Z”形设点，于2009年9月12日大豆成熟期取样，选取种植大豆1、2、3、6、9、11和13年的试验小区，收获30株大豆，连根拔起植株。用抖根法采集根际土，即抖动植株至土壤不再下落，粘在根系的即为根际土壤。土壤样品含水量为(16±3)%。根际土壤过2 mm筛，去除植物组织和土壤杂质。采集的样品放于冰盒中运回实验室，-20℃保存。

1.4 土壤总DNA的提取和PCR扩增

1.4.1 土壤总DNA的提取本实验的土壤DNA提取采用FastDNA SPIN Kit for Soil试剂盒(Bio 101, Carlsbad，CA，USA)。提取出来的土壤基因组DNA在-20℃冰箱中保存、备用。DNA通过1%的琼脂糖凝胶电泳后，用DNA green染色，成像系统拍照。

1.4.2 PCR扩增和纯化线虫扩增引物对为NEMF1(5′-CGC AAA TTACCC ACT CTC-3′)和S3(5′-AGT CAA ATT AAG CCG CAG-3′)[18]。进行T-RFLP分析时，引物NEMF1 5'端用6-羧基荧光素(FAM)标记。

PCR反应体系(50 μL)含DNA模板1 μL，EasyTaq 缓冲液5 μL，dNTPs(2.5 mmol/L)4 μL，NEMF1(10 mmol/L)0.6 μL，S3(10 mmol/L) 0.6 μL，Easy taq聚合酶(5 units/μL)(全氏金)0.6 μL，双蒸水(ddH2O)38.2 μL。

总而言之，根据本次研究数据就进一步证明了对急性脑卒中患者康复过程中实施良肢位摆放护理具有显著地效果。良肢位摆放护理可以根据患者的实际情况来制定具有针对性的护理方案，从而提高患者在护理过程中的舒适度与满意度。因此，良肢位摆放护理应该被积极应用在临床实践的过程中。

PCR扩增条件为94℃预变性5 min，35个循环：94℃变性1 min，53℃引物退火45 s，72℃延伸1 min。最后72℃末端延伸10 min。PCR产物3 μL用1%琼脂糖凝胶电泳检测，使用凝胶回收型试剂盒(天根生化科技(北京)有限公司)对PCR产物纯化，-20℃保存。

1.5 T-RFLP分析

在3 μL PCR产物中，加入0.6 μLTaqⅠ限制性内切酶(Takara)，2 μL缓冲液，最后用ddH2O补足到反应总体积10 μL。65℃，遮光酶切3 h。酶切产物用乙醇沉淀法纯化，纯化产物用锡箔纸包裹，在-20℃下保存。在1 μL酶切纯化产物中加入8.8 μL甲酰胺，0.2 μL Rox 1000内标(Bioventures Int., 美国)，共10 μL混合液，然后加到96孔板，要避免产生气泡，否则可能损坏遗传分析仪。在95℃变性3 min，然后迅速移到冰上冷却3 min。在ABI 3130自动测序仪上检测时，电压为2500 V，电流40 Ma，功率27 W。末端带荧光标记的片段能被自动检测到，而其它没有带荧光标记的片断检测不到。用Peak Scanner Software v1.0分析T-RFLP图谱，然后将末端限制性片段(T-RF) > 50 bp的峰高计算不同片段的相对丰度。

表1 大豆连作根际土壤性质、类黄酮、大豆苷元和染料木素含量Table 1 Soil properties and concentrations of isoflavones, daidzein and genistein in the rhizosphere soil over years of mono-cropping

注(Note): 同列数据是平均值加标准误Date are means±SD (n=3). 不同的字母表示在P<0.05水平上年份间存在显著差异 Different letters mean significant difference among different years atP<0.05 level. 数据来源于Guo等[22]和Wang等[23]Data are adapted from Guoetal.[22]and Wangetal.[23].

1.6 克隆及测序分析

用与T-RFLP序列相同但不带荧光标记的引物进行PCR扩增，扩增条件也与T-RFLP的相同。以PCR产物进行切胶回收纯化。纯化产物采用pMD 19-T Vector (Takara)试剂盒连接到载体上，转化感受态细胞(Takara)，涂布到含有氨苄青霉素(Ampicillin)、X-Gal和IPTG的LB(Luria-Bertani)培养基上，37℃过夜培养，约12h，形成单菌落。随机选取170个白色克隆子，采用菌体直接扩增，检测到的阳性克隆送往测序公司进行测序，测序引物为M13-47。先用Clustal X软件对所得序列去除载体序列[25]，然后利用RDPⅡ在线数据库(http://wdcm.nig.ac.jp/RDP/cgis/chimera.cgi?su=SSU)去除PCR扩增过程中产生的嵌合体。然后用Clustal X和Mega5.0软件分析比对，采用邻接法(neighbor-joining)构建系统发育树。

1.7 实时荧光定量PCR

利用实时荧光定量PCR，采用绝对定量的方法确定线虫群落的大小。用阳性克隆质粒绘制线虫基因的定量PCR标准曲线。引物为NEMF1/NEM896r(5′-TCC AAG AAT TTC ACC TCT MAC G-3′)。实验采用Power SYBR Green PCR Master Mix试剂盒(ABI)，在7500 Real Time PCR system(ABI)仪器上进行。实时荧光定量PCR 25 μL反应体系为：12.5 μL SYBR Green；引物各1 μL(10 μmol/L)，5 μL ddH2O，0.5 μL BSA(0.1%)，模板DNA 5 μL。反应程序为：50℃ 2 min，启动dUTP防止非特异性扩增；95℃ 10 min，激活热启动酶；然后45个循环的PCR反应：94℃变性1 min，53℃引物退火45 s，72℃延伸1 min，72℃收集荧光信号，最后做溶解曲线。根据标准曲线，用7500 system SDS Software(ABI)分析定量结果。

1.8 数据处理

利用Mental test确定环境因子对线虫群落的影响。布雷柯蒂斯(Bray-Curtis)距离用来进行非度量多维尺度分析(NMDS)，分析群落的变化。Mental test和NMDS均在R软件vegan软件包中进行。方差分析和相关性分析在SPSS 17软件中进行。

2 结果与分析

2.1 线虫群落结构

线虫的物种丰富度随着连作年限的增加呈逐渐降低的趋势。第1年物种丰富度最高，为12，第3年的丰富度显著低于第1年(P<0.05)，之后逐渐降低，连作9年后达到最小值，为5(图1)。

图1 长期连作大豆根际土壤线虫群落的物种丰富度变化Fig.1 Changes of species richness of nematode communities in long-term continuous soybean monoculture[注(Note)：数据是平均值加标准误Date are means ± SD (n=3). 方柱上不同字母表示在P<0.05水平存在显著差异 Different letters above bars are significantly different at P<0.05 level (according to Duncan’s new multiple range tests).]

图2 长期大豆连作线虫群落的结构和组成 (基于线虫基因的T-RFLP分析)Fig.2 Compositions and structures of nematode communities in the long-term continuous soybean monoculture as determined by the T-RFLP analysis

2.2 线虫群落组成与环境的关系

T-RFLP分析中的大多T-RF能从克隆文库中鉴定(图3)。在大豆根际土中，线虫群落由茎线虫属(Ditylenchus对应416 bp和556 bp)、真滑刃属(Aphelenchus对应553 bp)、拟丽突属(Acrobeloides对应62 bp、74 bp、556 bp和557 bp)、针属(Paratylenchus对应418 bp、549 bp、555 bp和558 bp)、盘旋属(Rotylenchus对应562 bp)、孢囊属(Heterodera对应559 bp和560 bp)、中小杆属(Mesorhabditis对应73 bp、75 bp和522 bp)组成。线虫群落主要分成植食性线虫、食细菌线虫和食真菌线虫，没有检测到杂食性线虫(图3)。

图3 线虫克隆文库系统发育树Fig.3 Phylogenetic relationship of representative nematode clone sequences

NMDS分析显示，第1年线虫群落与其余年限分开，而第2和第3年聚集较近，后面第9、11和13年聚集较近(图4)。说明短期连作导致了群落的明显变化，随着连作年限的增加，线虫群落进一步分化，暗示了连作时间对线虫群落结构并没有恢复。Mantel test分析显示环境与线虫群落之间存在显著的关系(相关系数r=0.368，P<0.001)，暗示了环境条件对于群落的变化起到了部分的作用。线虫群落结构与pH、土壤有机质(SOM)、速效磷(AP)、细菌数量和真菌数量相关(图4)。

2.3 定量分析

图4 NMDS分析长期大豆连作的线虫群落结构与环境的关系Fig.4 Nonmetric multi-dimensional scaling (NMDS) plots showing similarity between nematode community structures from the continuous soybean monoculture system[注(Note)： BA—细菌丰度；FA—真菌丰度；AP—速效磷；SOM—土壤有机质.]

图5 长期大豆连作线虫的基因拷贝数变化Fig.5 Gene copies of soil nematode in the long-term continuous soybean monoculture[注(Note)：数据是平均值加标准误Date are means±SD (n=3). 不同字母表示在P<0.05水平年份间存在显著差异 Different letters mean significant difference among different years at P<0.05 level (according to Duncan’s new multiple range tests).]

3 讨论

在长期连作情况下，会出现由致病土壤向抑病土壤的转化。例如，许多地方的研究表明持续连作使土壤出现自然抑制病原线虫的现象[5]。欧洲的荞麦连作减少了胞囊线虫(Heteroderaavenae)种群的密度[26]。在我国东北地区，大豆连作前5年，胞囊线虫数量每250 g土增加到351个，之后开始下降，并在连作14年后降到260个[6]。

图6 长期大豆连作土壤中线虫群落基因拷贝数和环境因子的关系Fig.6 Nematode community gene copies association with environmental factors in the long-term soybean monoculture

土壤线虫群落的变化并不是偶然的，其消长通常受土壤理化性质和微生物的影响[33]。本研究发现，线虫群落结构受有机质、有效磷和pH值的影响，而且细菌和真菌的数量也影响着线虫结构(图4)。土壤有机质是影响土壤线虫分布的重要因素[34]。土壤有机质为土壤微生物提供了能源，因此增加了微生物的活性和生物量。一些食细菌线虫的增加可能是由于微生物生物量增加引起[35]。另外，土壤pH降低通常减少了细菌生物量而有利于真菌生物量，这样的变化能够反映在捕食微生物的线虫群落变化上[36-37]。番茄连作过程中，pH值与垫刃科(Tylenchidae)线虫数量呈正相关，还有一些滑刃线虫(Aphelenchoidesspp)对pH值具有较强的忍耐性[32]，说明不同的线虫种类对pH值的响应存在差异，可能引起群落变化。土壤磷含量高能增加线虫的丰度，特别是食细菌线虫数量，改变了食真菌和食细菌线虫数量[37]。王邵军等[38]发现，柳杉根际的速效磷与垫刃线虫(Tylenchusplatycephalus)及居尾滑刃线虫(Aphelenchoidescomposticola)数量正相关，而与厄萨拉斯螺旋线虫(Helicotvlenchusxallus)和双宫螺旋线虫(Helicotylenchusdihystera)无关。这些结果说明连作引起的土壤性质的改变引起了土壤线虫群落的分化。另外，细菌和真菌是捕食微生物的食物来源，微生物的数量对线虫群落结构的调节也十分明显[33]。

本研究中并没有检测到捕食/杂食线虫(Omnivores-predators)。这可能是由于研究方法的差异。本研究主要研究根际土，而且DNA是从0.5 g土壤中提取，不能全面地估计线虫分布。因此，为了更全面研究线虫群落结构，需要经典分类和分子技术相结合[42]或从更多质量的土壤中提取DNA，再用高通量的测序方法进行群落结构鉴定[43]。

4 结论

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Effects of continuous soybean monoculture on soil nematode community

WANG Jin-chuang1,2, WANG Jing-guo1*

(1CollegeofResourcesandEnvironmentalSciences,ChinaAgriculturalUniversity/MOAKeyLaboratoryofPlantNutrition,Beijing100193,China; 2EnvironmentandPlantProtectionInstitute,ChineseAcademyofTropicalAgriculturalScience,Haikou,Hainan571101,China)